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第七章免疫电镜一电镜免疫组织化学技术概述二几种常用的透射电镜方法要点一电镜免疫组织化学技术概述特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。（一）组织固定与取材（二）免疫染色（三）包埋（四）对照试验（一）组织固定与取材原则：既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。固定：固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。影响固定的因素有：①固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的pH；④固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞自溶作用和水分抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；⑥与被固定的细胞类型有关。选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。多聚甲醛—戊二醛混合液过碘酸—赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液)：对含糖类丰富的组织固定效果特佳。（使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。）取材：免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。灌流后需续固定：四氧化锇（二）免疫染色包埋前染色包埋后染色超薄切片免疫染色1包埋前染色即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋：即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAP），免疫反应部位呈黑点状；HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。取相连续的超薄切片为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。包埋前染色法的优点是：①切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。②在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。适用含抗原量较少的组织。2包埋后染色（载网染色）组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片；免疫组化染色（载网染色）注意事项：①四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。②在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。优点：超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。缺点：抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失；环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。解决对策：去除包埋剂：饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等。去除四氧化锇：免疫染色前，将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟，以去锇和增强树脂的穿透性。3超薄冰冻切片将组织置于蔗糖保护液中，以液氮速冻；在冰冻超薄切片机上切片；免疫染色。不需经固定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条件要求较高、难度较大。（三）包埋树脂包埋、低温包埋1树脂包埋环氧树脂包埋法直接脱水后包埋原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行包埋。2低温包埋低温包埋剂：（1）Lowicryls：是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列产品。特点：是能在低温下保持低粘度；具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用与温度无关。K4M和K11M具有亲水性，能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色；HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。K4M应用较多1）包埋剂的配制：由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。中等硬度的组织块，其配制比例如下：K4M：单体17.30g交联剂2.70g引发剂0.10g可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用玻棒轻搅3—5min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。K4M的应用2)生物样品处理程序①取材，以多聚甲醛一赖氨酸—过碘酸钠固定；②含7％蔗糖PBS，冲洗过夜；③0.1mol／LPBS，pH7.2冲洗；④系列脱水；⑤包埋：新鲜K4M置于胶囊内，将组织块移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。3)免疫染色①切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上；②正常羊血清30min；③稀释一抗，37℃2h；④可用烧杯法(或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在烧杯中洗荡；⑤正常羊血清30min。⑥二抗以正常羊血清稀释，以镍网置于血清滴上孵育。⑦冲洗如④。⑧覆于2％OsO4水溶液上，30min。⑨冲洗如④。⑩干燥后在电镜下观察。注意事项：所有步骤在室温、湿盒内进行；所有溶液需经微孔滤纸滤过。Lowicryls应保存在暗处，一4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。（2）LRwhite和LRgold是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂；具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体(或抗原)和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位；在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至70％乙醇即可，能较好地保持抗原性。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。（3）GMA（乙二醇甲基丙烯酸酯）优点：①电子密度大；②影像反差好。缺点：①包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。②聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。③缺乏稳定性，不能承受电子束轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。环氧树脂：有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形；影像反差好，分辨率高；半薄切片染色不够满意，效果不如GMA包埋切片的染色效果。改进方法：增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇400改变其硬度。使之变软；加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束轰击的稳定性。选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构。GMA已广泛应用于半薄切片(1～3um)的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。1)过滤:GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。2)包埋剂的配制：a.100％GMAN-甲基丙烯酸丁酯66.5ml5％乙烯二甲丙烯酸酯28.5ml1.5％过氧化苯甲酰1.0g1.0％PEG4001.0mlGMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法：b．A液：GMA单体液90mlPFGz3005～9.4ml过氧化苯甲酰0.2～0.69g搅拌溶解后置棕色瓶内；4℃保存。B液：PEGz40020ml二甲基苯胺1ml应用时A：B按10：1比例充分混。3)生物样品处理：组织固定可用PLP液或1％戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制，Ph7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。以上步骤可在室温或4℃进行。4)包埋聚合：组织移入盛满包埋液的胶囊内，放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在4℃，以紫外线灯(波长360nm)在距胶囊底部10～20cm处进行照射12～16h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中以去除胶囊外壳。5)包埋后染色:切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白A技术（PAg法）进行包埋后染色，铀、铅双染后，电镜观察。▲低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。（四）对照试验:略免疫电镜技术存在的问题：▲戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响；▲H202能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。▲染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染物，影响特异性反应产物的显示和观察。二、几种常用的透射电镜方法要点（一）铁蛋白标记免疫电镜技术（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术（三）胶体金标记免疫电镜技术（四）凝集素标记免疫电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术1原理铁蛋白：是一种含铁约占23％的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离子核心，含2000～3000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。抗体与铁蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物保留了抗体的免疫活性，通过电镜可定位抗原。适于细胞表面抗原的定位优点：铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨；缺点：分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞内抗原的定位较困难。只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。2电镜标本的制备（1）固定同常规电镜（醛类和四氧化锇双固定）铁蛋白标记抗体分子量大，如用于细胞表面抗原的定位研究，可将样品直接放入固定液；细胞内抗原测定需：冻融法：固定后冻融使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。冰冻切片法：固定后速冻，切成10-15um薄片，融化的切片直接浸泡于铁蛋白标记的抗体液中。戊二醛固定后，浸入洋地黄皂甙液中1-2min，增强细胞膜穿透性，使标记抗体进入细胞内冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图艾滋病患者血清的免疫电镜所见。在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞外所见相同的病毒颗粒。培养的成纤维细胞质膜对LDL的内吞作用LDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连，电子显微镜下所见的黑点是小分子的铁。（a）LDL与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（b）含有LDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（c）含有转铁蛋白标记的LDL被膜小泡；（d）含有转铁蛋白标记的LDL颗粒的无被小泡（初级内体）。（2）免疫染色方法常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。（1）直接法：切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或37℃1～2h以上；缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液；再按常规电镜后固定、脱水、包埋。（2）间接法：将切片浸入一抗室温孵育30～60min；大量冷缓冲液充分洗涤(3×30min)；浸入铁蛋白标记二抗中，室温孵育30min；充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片；将离心沉淀小块，用四氧化锇固定30分钟；常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术1原理：利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成有较高电子密度的产物。HRP分子量小(40000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。2方法（1）单层细胞培养物免疫酶染色法①用4%多聚甲醛原位固定1h;②PBS充分洗涤，用HRP标记的抗体血清作用18h，再用PBS水洗；③2%戊二醛固定1h，再水洗；④DAB显色⑤锇酸固定、树脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片（2）组织切片酶标记抗体染色法①1mm厚组织块，固定后如蔗糖保护液;②做10-40um冰冻切片，放入一抗血清作用12-18h，用含蔗糖的PBS水洗；③置于HRP标记抗体液4℃过夜，再水洗，浸漂过