第九章疾病与人类健康

第九章疾病与人类健康•肿瘤与癌症•人免疫缺陷病毒——HIV•乙型肝炎病毒——HBV•人禽流感的分子生物学机制•严重急性呼吸系统综合症——SARS的分子机制•基因治疗Contents第一节肿瘤与癌症内容提要：反转录病毒致癌基因原癌基因（细胞转化基因）产物及其分类原癌基因的表达调控基因相互作用与癌基因表达癌：是一群不受生长调控而繁殖的细胞，也称恶性肿瘤。良性肿瘤：是一群仅局限在自已的正常位置，且不侵染周围其他组织和器官的细胞。细胞癌变的分子基础：基因突变一、癌基因（oncogene)•癌基因的分类1.病毒癌基因：(virusoncogene,v-onc)DNA病毒(乙肝病毒)、RNA病毒（反转录病毒）2.细胞转化基因：(cellular-oncogene,c-onc)原癌基因的突变产物。(一)反转录病毒致癌基因（P339）Rous于1910年首先发现鸡肉瘤病毒（后称劳斯肉瘤病毒RSV），研究证明它是一种反转录病毒，接种给鸡后可诱发肉瘤。1966年，85岁的劳斯获得诺贝尔奖。1、反转录病毒颗粒结构（P339）调节和启动转录LTRgagpolenvsrcLTR长末端重复序列癌基因正常的病毒基因产生病毒表面糖蛋白产生逆转录酶和整合酶产生病毒垮膜蛋白2、反转录病毒基因组结构产生p60src蛋白质，磷酸化蛋白。靶蛋白磷酸化（P341）3、反转录病毒的复制断裂基因完整的没有断裂的可读框(二)细胞转化基因细胞转化基因实质上就是由一类原癌基因突变而来。当原癌基因在某些外界因素（如放射线、化学致癌物等）的作用下，发生数量和结构上的微细变化，形成了致癌性的细胞转化基因，从而使正常细胞转化为肿瘤细胞。原癌基因是细胞内与细胞增殖相关的正常基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。1、原癌基因原癌基因的特点:广泛存在于生物界中；基因序列高度保守；作用通过其产物蛋白质来体现；正常情况下表达水平很低;被激活后，形成致癌性的细胞转化基因。原癌基因的分类：根据原癌基因产物在细胞中的位置，可分为：•与膜结合的蛋白，如src基因产物；•可溶性蛋白，如mos基因产物；•核蛋白，如myc基因产物。根据原癌基因表达产物的功能，可分为：•蛋白激酶类，如Src家族（酪氨酸蛋白激酶类）•生长因子类•生长因子受体类•GTP结合蛋白类，如Ras家族•核蛋白类（DNA结合蛋白），如Myc家族•未知功能类原癌基因：单拷贝、正常情况下低水平表达或根本不表达癌基因？？当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。碱基缺失或单碱基突变基因扩增染色体重排蛋白质活性大大提高蛋白质未变化，但总量大大提高增强子功能使癌基因高效表达与强启动子基因相融合，提高癌基因表达效率原癌基因2、原癌基因的激活机制（P346）（1）点突变（2）LTR（longterminalrepeat)插入强启动子（3）基因重排（rearrange)（4）缺失（Deletion）oncogene(-)cancer一些原癌基因5’上游存在负调控序列，该序列的缺失或突变，则丧失抑制癌基因表达的能力。Brukitt淋巴瘤中c-myc因负调控序列缺失或LTR插入而增强表达。（5）基因扩增蛋白质结构未变化，但总量大大提高基因扩增原癌基因使每个细胞中基因拷贝数增加，从而直接增加可用的转录模板数以增加基因表达。3、基因互作与癌基因表达（1）染色体构象对原癌基因表达的影响基因表达不仅取决于基因本身及其相邻区域的一级结构，也取决于其空间构象，即基因在染色体上的空间排列和染色质的结构。当两个基因相距太近时，往往不易形成有利于高效转录的空间结构。•基因领域：基因与基因之间的间隔距离•基因领域效应：同一DNA链上两个具有相同转录方向的基因间隔小于一定长度时，影响有效转录所必需的染色质结构的形成，从而使这两个基因中的一个或两个均不能转录或转录活性显著降低。0.3kb-5kb，最佳间隔距离与两个基因的总长度成正相关。（2）原癌基因终产物对基因表达的调控1.某种原癌基因产物对另一种原癌基因表达的调控作用；2.某种原癌基因产物对自身表达的反馈调控作用癌基因产物通过介质传递生长刺激信号的部位有3处：①癌基因产物本身模拟了生长因子，因而与相应的受体作用，以自分泌的方式刺激细胞生长；②癌基因产物模拟了已结合配体的生长因子受体，从而在无外源生长因子时提供了促进细胞分裂的信号；③癌基因产物作用于细胞内生长控制途径，解除此途径对外源刺激信号的需求。（3）抑癌基因产物对原癌基因的调控抑癌基因(tumorsuppressorgene)/隐性癌基因：是一种抑制细胞生长和肿瘤形成的基因。如：Rb抑癌基因、抑癌基因p53抑癌基因与原癌基因在生物学上有以下几点差异：①在功能上，抑癌基因起负调控作用，而原癌基因起正调控作用；②在遗传方式上，原癌基因是显性的，而抑癌基因在细胞水平上是隐性的，③在突变发生的细胞类型上，抑癌基因突变可以发生在体细胞中，也可能发生在生殖细胞中并通过生殖细胞得到遗传。原癌基因突变只发生在体细胞中。（4）外源信号对原癌基因表达的影响•细胞外信号（包括生长因子、激素、神经递质、药物等）作用于靶细胞后，通过细胞膜受体系统或其他直接途径被传递至细胞内，再通过多种蛋白激酶的活化，对转录因子进行修饰，然后引发一系列基因的转录激活。第六节基因治疗•基因治疗的主要途径•基因治疗中的病毒载体•基因治疗中的非病毒载体基因治疗（Genetherapy）基因治疗（Genetherapy）：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）•ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。ADA-Gene+vector（逆转录病毒）重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂10天Gene表达回输患儿体内1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%2、乙型血友病•XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。•例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。逆转录病毒载体+FⅨcDNA重组体5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。3、黑色素瘤的基因治疗•肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞——TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗①IL-2Gene②TNF-Gene（白介2）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体导入TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。4、自杀基因的基因治疗原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。如：自杀基因+病毒载体转染重组载体药物前体无毒Gene→酶→↓药物复合物有毒细胞死亡例如：单纯疱疹病毒哺乳动物细胞HSVGene-TK（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）Gene—TKGCV（胸苷类似物）TdRPpGCV---p抑制DNA合成脱氧胸苷酸肿瘤细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）一、基因治疗的主要途径•1990年第一次利用反转录病毒为载体，把DAA基因导入来处患者的T-淋巴细胞，经扩增后输回患者体内，获得成功。标志站基因治疗时代的开始。•基因工程与基因治疗的区别：宿主表达——直接表达可分泌蛋白——所有基因体外完成——人体细胞exvivo和invivo途径•exvivo:将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）细胞，经体外扩增后输回人体。这种方法易操作，安全性好，但不易形成规模。•invivo:将外源基因装配于稳定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。这种方法非常有利于大规模工业化生产，但技术难度大，安全性必须证明。二、基因治疗中的病毒载体•基本条件：1.携带外源基因并能装配成病毒颗粒2.介导外源基因的转移和表达3.对机体没有致病力——大多数野生型病毒对机体都有致病性，需要对其进行改造后才能用于人体。病毒载体的产生•研究病毒基因组的结构和功能•将外源基因插入病毒基因组的非必需区•将重组病毒进行改造•——复制缺陷型•——删除致癌基因•——扩大容量等病毒载体的分类•重组型病毒载体：不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件，有选择性的删除病毒的某些必需基因，特别是前早期或早期基因以控制其表达，所缺失的必需基因的功能由同时导入细胞中的外源基因表达单位提供。一般通过同源重组的方法将目的基因插入到病毒基因组中。•无病毒基因的病毒载体：由重组载体和辅助系统组成。重组载体主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及载体骨架所组成。辅助系统包括病毒复制和包装所必需的反式作用因子。重组载体以特定形式被包装到不含有任何病毒基因的病毒颗粒中。安全性好、容量大。但会产生辅助病毒污染。病毒载体在基因治疗中的应用•P379表9-9常用病毒载体的特性和适用范围基因治疗中的问题1.靶向性基因导入系统2.外源基因表达的可控性3.治疗基因过少三、基因治疗中的非病毒载体1.裸DNA2.脂质体载体3.阳离子多聚物型载体1、裸DNA•又称自由DNA，结构简单。•困难：如何将目的基因导入相应的细胞并得到长期有效的表达•方法：主要通过物理或机械方法（如直接注射或基因枪法）将DNA导入适当部位。•DNA疫苗•缺点：缺乏靶向性2、脂质体/DNA复合物•脂质体：具有双层膜的封闭式粒子，能促进极性大分子穿透细胞膜。•类型：阳离子脂质体（最常用？）、阴离子脂质体、PH敏感脂质体及融合脂质体等•脂质的化学结构、组成对载体的活性和毒性有很在的影响•细胞主要通过内吞途径摄取脂质体，遇到溶酶体即被降解•PH敏感脂质体在酸性条件下脂肪酸羧基质子化，形成六角晶相发生膜融合。三、多聚物/DNA复合物•DNA带负电，利用阳离子多聚体的氨基基团的正电荷与DNA的磷酸基团结合发生电性中和，可以使DNA缩合形成稳定的多聚复合物，不易被核酸酶降解，并可防止沉淀，从而提高转染效率。•可与细胞表面的带负电的受体结合，能被有效内吞摄入，介导基因转移•合成方便、安全无毒，但组织特异性和靶向性差、体内基因转移效率低。四、DNA微球体•白明胶和聚氨基葡萄糖等生物高聚物属于阳离子复合物，能与DNA形成大小为200-750nm的微球体复合物。•特点：——可降解——分布均一——共包装——储存方便——持续释放——毒性低第二节人免疫缺损病毒——HIV•HIV病毒粒子的形态结构•HIV基因组及其编码的蛋白•HIV的复制P24CapsidproteinP18Matrixprotein一、HIV病毒粒子的形态结构二、HIV基因组及其编码的蛋白编码病毒的核心蛋白编码反转录酶、整合酶和蛋白酶编码外膜蛋白TATandREVareessentialforHIVreplicationGAGgene-p55p17:innersurfacep24:nucleocapsidp9:nucleocapsidassociatedwithRNA1.Polymerase(reversetranscriptase)2.Integrase3.Protease(cutspolyproteins)•POLgeneMemb