细胞周期调控

细胞周期调控细胞增殖周期，简称细胞周期(cellcycle)，是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂结束为止所经历的整个序列过程。这个过程所需要的时间称为细胞周期时间。细胞周期细胞周期周而复始地进行着，这种周期性的重复过程受到严格地控制，使得不同的细胞周期事件在空间和时间上相互协调。研究背景细胞周期的检验点细胞周期蛋白CDK及其调控生长因子、癌基因和抑癌基因细胞周期与肿瘤内容提要一、研究背景1.MPF的发现及其作用1960年，Masui和Markert研究爪蟾卵母细胞，提出了成熟卵母细胞中存在一种促成熟因子（maturationpromotingfactor，MPF）。Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela细胞为材料，发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即促细胞分裂因子(mitosis-promotingfactor，MPF)。2.cdc基因LelandHartwell、PaulNurse分别以不同的酵母为实验材料，发现了许多与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。进一步研究发现：P34cdc2与P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：P34cdc2必须与另一种蛋白P56cdc13结合后才具有激酶活性。3.cyclin1983年TimothyHunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，在下一个周期中又重复这一消长现象，故命名为周期素或周期蛋白(cyclin)。随后cyclin很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。4.MPF－P34cdc2－Cyclin？？1988年M.J.Lohka纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由34KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。1990PaulNurse进一步的实验证明P34实际上是P34cdc2的同源物，P45是cyclinB的同源物，而且，对于P34cdc2的活性而言，cyclin是必需的。从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。MPF=P34cdc2(CDK1)+CyclinB（催化亚单位）（调节亚单位）TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2001fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecellcycleLelandHartwellTimothyHuntPaulNurse二、细胞周期的检验点1989年，Hartwell通过构建酵母细胞突变模型证实了细胞周期检验点（checkpoint）的存在，并首次提出检验点的概念。细胞周期的运行，是在一系列检验点的严格检控下进行的，它保证前一个事件完成之后，才启动下一个事件，检查点是细胞的错误监测机制。G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：所有DNA都正确复制了吗？DNA是否有损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：所有染色体都排列在纺锤体上了吗？任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，引起细胞周期中断。三、细胞周期蛋白cyclin的种类繁多，目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分别参与细胞周期中不同时相的调节。分为G1型、G1/S型S型和M型4类。人类细胞周期蛋白线性结构示意图实心方框代表“cyclinbox”，方框代表“destructionbox”圆形框代表PEST序列cyclinbox：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclinbox)，介导周期蛋白与CDK(cyclin–dependentkinase)结合。Cyclin也含有降解盒（destructionbox）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－丝氨酸－苏氨酸）序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚基的作用。G1期：细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录。CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2FG1/S期：cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。向细胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的参与。S期：将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制所必需的。G2/M期：cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化,如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。M期：在分裂中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC(anaphasepromotingcomplex)，负责将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。哺乳动物细胞周期中各时相不同cyclin的作用四、CDK及其调控CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin–dependentkinase,CDK)，控制着细胞周期各期之间的顺序转换。CDK是一组相关联的Ser/Thr蛋白激酶，酵母中细胞周期的进程主要由单一的CDK（P34cdc2/cdc28）所控制。多细胞生物中，细胞周期各期之间的转换需要不同的CDK。脊椎动物的CDKCDK结合的相应cyclin作用的细胞周期CDK1CDK2CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7CyclinA,BCyclinACyclinD1,D2,D3CyclinECyclinD1,D2,D3P35*,CyclinD1,D2,D3CyclinD1CyclinH,P36*G2/M转换；M早期S期G1期G1/S转换G1期G0/G1转换、G1期神经纤维的磷酸化、G1期G0/G1转换活化CDK*P35，P36的结构与细胞周期蛋白无相似性1．Cyclin的结合是CDK激活的第一步CDK活性的最初调节者是cyclin亚单位。Cyclin与相应的CDK结合后，引起CDK空间构象改变，暴露其催化亚基。各种细胞周期蛋白程序化的合成和降解保证各对应CDK适时的活化，维持细胞周期的正确时序。2．CDK的磷酸化与去磷酸化以P34cdc2(CDK1)为例，如果对P34cdc2磷酸化作用位点不同，则对该酶的活性分别产生正向和负向的控制。完整的P34cdc2-cyclin复合物需要磷酸化才能被激活，驱动细胞进入有丝分裂。P34cdc2的Thr14和Tyr15的磷酸化引起P34cdc2-cyclin复合物的失活，Weel是催化Tyr15磷酸化的激酶，另有一个是Thr14磷酸化的激酶；催化Thr14及Tyr15脱磷酸化的蛋白磷酸酶为双特异性磷酸酶Cdc25蛋白。P34cdc2的Thr161的磷酸化是酶的活性所必需的。CDKs活化激酶CAK（CDKsactivitingkinase）应答Thr161的磷酸化，这是另一种蛋白激酶CDK7-CyclinH复合物。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。3．CDK抑制剂的作用除了磷酸化／去磷酸化可以调节MPF活性外，另有一类CDK抑制因子（CDCkinaseinhibitor,CKI）可与CDK结合抑制其活性。（1）Ink4(Inhibitorofcdk4)如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，专一地与CDK4、CDK6结合，阻止CDK和cyclinD的结合。使细胞周期不能从G1期的调控点进入到下一个时相。（2）Cip/Kip包括P21cip1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能与多种cyclin-CDK复合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–CDK4结合，抑制cyclin-CDK复合物的蛋白激酶活性，使一些细胞增殖所需要的蛋白质磷酸化受阻，细胞停留在G1期。此外P21cip1还可与DNA聚合酶δ亚单位PCNA(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)相互作用，抑制DNA复制，但不影响DNA修复。CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化五、生长因子、癌基因和抑癌基因1．生长因子生长因子是促细胞周期运行的重要因子。RTK-Ras-MAPK信号传递途径是细胞外的信号传递到细胞核内最基本的途径。2．癌基因原癌基因被激活，其编码蛋白大量表达，这些蛋白对细胞周期具有促进作用。癌基因癌蛋白种类来源存在功能类型1：生长因子sis逆转录病毒分泌生长因子（PDGF)类型2：生长因子受体erbB逆转录病毒膜表皮生长因子（EGF)受体fms逆转录病毒膜集落刺激因子－1（CSF-1)受体trk肿瘤膜神经生长因子（NGF)受体类型3：细胞内信号蛋白Src逆转录病毒细胞质酪氨酸激酶Raf逆转录病毒细胞质丝氨酸激酶Ras逆转录病毒、肿瘤细胞质GTP/GDP结合蛋白类型4：核转录因子Jun、Fos逆转录病毒核转录因子（AP-1)Myc逆转录病毒、肿瘤核DNA结合蛋白erbA逆转录病毒核类固醇受体家族成员癌基因的主要类型及其表达产物3．抑癌基因抑癌基因可抑制细胞周期于静止期，并使DNA复制不完全或损伤的细胞不能进入分裂期，避免细胞的癌变。（1）P53一般情况下，细胞中很少有P53蛋白。DNA损伤会引起P53蛋白浓度和活性的提高。P53蛋白可同P21基因调节区结合，激活P21基因转录。使细胞停滞在G1期的调控点处不能进入S期。这样，即可有足够的时间修复DNA。P53蛋白可促进GADD45基因（growtharrestandDNAdamageinduciblegene）表达生成GADD45蛋白，后者与CDK及PCNA形成的复合物，参与DNA损伤的修复。当DNA损伤不能修复时，p53基因的过量表达导致P34cdc2的过早激活，结果使核膜破裂，引起细胞凋亡。（2）RbRb基因位于人染色体13q14，由27个外显子构成，分布在总长180-200kb以上的DNA片段上。Rb基因转录的mRNA大小为4.7kb，编码一个分子量为105kD的蛋白质，由928个氨基酸残基构成，定位于细胞核内，是多种cyclin-CDK的底物，具有多个被磷酸化的位点。Rb有高、低磷酸化两种状态。低磷酸化的Rb蛋白可与一些转录因子如E2F结合，抑制这些转录因子的活性，阻止细胞的生长。而高磷酸化状态则失去这种功能，使E2F游离，进入核内，发挥转录活性，促进细胞周期进行。Rb在细胞周期内的磷酸化六、细胞周期与肿瘤肿瘤细胞最显著的特点是生长失控和幼稚化（即不分化）。（一）肿瘤细胞周期失控的分子基础1．细胞周期蛋白异常G1cyclin基因突变、重排，使这些cyclin异常表达，从而使细胞通过G1期，进入S期，细胞即自发增殖，出现转化特征。许多人类肿瘤中，均发现有cyclinD1基因的扩增。B型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HVB）感染人体后成为导致肝癌的因素之一，有研究发现，HVB基因组整合入cyclinA基因的一个内含子中，产生异常、过量表达的转录物。和正常的cyclinA相