第十三章--体外受精与动物克隆技术

第十三章体外受精与动物克隆技术第一节胚胎工程胚胎工程是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产和临床上具有广泛的应用，它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。近30年来，随着生物技术的发展，胚胎工程技术也日新月异，在促进畜牧业发展及其相关领域研究中取得了令人瞩目的成就。一、体外受精体外受精(InVitroFertilization，IVF)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等），使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体兔的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。试管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)婴儿(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)绵羊(Hanada，1985)猪(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等。1.精子的获能处理张明觉Austin1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能（capacitation）。精子的获能过程是多时期、多步骤的复杂变化过程，包括两个阶段，获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子（DecapacitationFactors，DF），增强了膜通透性。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。2.卵母细胞的采集和成熟培养（1）卵母细胞的采集①超数排卵②从活体卵巢中采集卵母细胞③从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞（2）卵母细胞的选择（3）卵母细胞的成熟培养3.体外受精（1）常规体外受精技术将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。通常情况下，受精液与获能液为同一种液体。（2）与分离精子相结合的体外受精技术将精子分离技术与体外受精技术结合起来生产预选性别的优良胚胎,对加速家畜品种改良和畜牧业生产具有重要的应用价值。（3）显微受精技术为了提高体外受精的成功率，借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质或透明带下，完成受精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精障碍，使受精率和准确率大大提高。4.受精卵的体外培养受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为“发育阻滞”。不同动物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为2细胞期，大鼠为8细胞期，牛和绵羊为8~16细胞，猪为4细胞期。目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。5.体外受精的意义家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进步，为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要的科学意义和实用价值。二、胚胎移植技术所谓胚胎移植（embryotransfer）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，所以也称为“借腹怀胎”。1．供体、受体的选择胚胎移植的供体一般是选择需要加速繁殖的有较大生产应用价值的健康的优良畜种，受体则是繁殖能力较强的健康本地品种。2．超数排卵用前面所述的超数排卵技术，在母牛发情期（发情期当天为零天）的第九天开始肌肉注射FSH，以递减剂量连续注射4天，每天注射两次（间隔12h），总剂量为300~400U；第三天的上下午，在注射FSH的同时肌肉注射氯前列烯醇（PGF2α的类似物）各两支（0.2mg/支）。3．同步发情同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。4．人工受精激素注射结束后，观察到发情后１２小时，开始第一次输精，时隔１２小时进行第二次输精，输精量是常规量的两倍。5．胚胎采集（1）手术法（2）非手术法6．胚胎的检查与鉴定1）检卵将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10一15分钟。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，在实体显微镜下先在低倍(10一20倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50—100倍)下观察胚胎质量。2）吸卵吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确，速度快，带液量少，无丢失。吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管。3）胚胎质量鉴定正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。7．胚胎移植1）手术移植先将受体母牛作好术前准备。已配种母牛，在右肋部切口，找到非排卵侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注人胚胎；未配母牛在每侧子宫角各注入一个胚胎；然后将子宫复位，缝合切口。2）非手术移植非手术移植一般在发情后第六至第九天(即胚泡阶段)进行，过早移植会影响受胎率。在非手术移植中采用胚胎移植枪和0．25毫升细管移植的效果较好。将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸人含胚胎的少许保存液，吸人一个气泡，最后再吸取少许保存液。将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。8．胚胎移植的意义①发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广应用；②缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；③长期保存冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；④是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的重要手段。三、胚胎分割技术所谓胚胎分割（embryosplitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。1.胚胎分割的方法（1）显微针分割法该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操作仪下将胚胎固定，用玻璃针在透明带上作一切口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使之离散，将其装入2个预先准备好的空透明带内，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。（2）显微刀分割法该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将胚胎均匀一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。（3）酶软化透明带后显微分割法用0.5%的链霉蛋白酶软化胚胎透明带,若是紧密化胚胎(如桑椹胚),则需在无钙、镁的平衡盐溶液中处理20分钟,使胚胎去紧密化，将胚胎固定，把将针置于欲分割的胚胎上面,使其与胚胎呈30度角,对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。（4）酶消化去透明带后分割法用0.25%～0.5%的链霉蛋白酶去掉胚胎透明带,然后用显微玻璃针或微手术刀将裸胚一分为二。（5）徒手分割法徒手分割法主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下，用止血钳夹住切割刀片，将透明带切开一部分，再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次，胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑椹胚和囊胚。该方法操作简便、快速，便于生产应用，但要求要有较为灵巧的操作技能。尽管胚胎分割技术已在多种动物包括人类取得成功，但是仍然存在很多问题须作深入研究。（1）胚胎分割产生的后代初生体重低，在牛切割胚胎移植实践中发现，有些分割胚即使培养到囊胚阶段与正常胚胎相比，细胞数明显减少，移植后代的体重也相应降低。这可能与早期胚胎细胞的分化和定位有关，但发育机理还有待深入研究。（2）还有遗传一致性问题，同一胚胎切割后获得的后代，在理论上，遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。人们发现6~7日龄牛胚胎分割后，同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同，而在2-细胞阶段分割，却表现出遗传一致性。这种现象与胚胎细胞的分化有密切关系，但目前对不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力了解很少；（3）最后还存在同卵多胎的局限性，从目前的研究来看，由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。迄今，最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊，这说明孪生胚胎的发育潜力很有限。因此，通过胚胎分割技术生产大量克隆动物目前难以取得进展。2.胚胎分割目前存在的问题和发展前景第二节核移植与动物克隆一、什么是动物克隆？动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆。体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做体细胞克隆。二、两栖类细胞核移植1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代．核供体为囊胚期的胚胎细胞——实验成功核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞——实验失败1958年到1962年，英国剑桥大学的JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾．1970年JohnGurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。三、鱼类的核移植从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响．1979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。四、哺乳类的细胞核移植1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有适量细胞松驰B的溶液中。经此番处理的卵细胞的染色体复制后出现了两个核，将此双核细胞放入正常培养液中培养。卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。将此种胚胎移入母鼠子宫培育。生产出7只单亲小鼠。1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室