中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用

中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用苗景赟孙文改解红艳(通用电气医疗集团GEHCLifeSciences)作为生物药物的“重磅炸弹”，大规模动物细胞培养生产治疗用单抗已成为生物制药发展的主导。MabselectSuRe亲和层析结合CaptoAdhere复合离子交换两步层析工艺已经成为抗体生产工艺的亮点，而中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的膜分离技术，具有容尘量高、温和低剪切力、操作灵活、成本低、易于放大等优点，因此广泛应用于重组蛋白、疫苗等生物制药领域。通过将中空纤维膜过滤技术和下游两步层析工艺相结合，可以成功的迎接几十甚至上百公斤单抗生产所面临的挑战。1.单抗的发展和面临的挑战近年来，高密度细胞培养技术和大规模蛋白质生产纯化技术的不断进步，推动了治疗用抗体产业化的发展。和传统的基因工程蛋白药物相比，治疗用单抗具有一些不同的特点：(1)高剂量单抗的给药剂量较高，一般从数百毫克到克级，且给药方式多为静脉注射。因此，抗体的生产规模和产品质量都面临着巨大挑战。为了满足日益增长的高剂量抗体药物需求，大规模细胞培养技术不断发展：细胞密度已达107~108cell/ml；表达量从1~5g/L增加到10g/L，甚至出现27g/L的表达量新高1；细胞培养规模从上千升增加到20,000升。这就要求开发一条高速、高载量的下游分离纯化工艺，以便能够快速处理上万升的培养液，并实现每批几十公斤甚至上百公斤抗体的生产。另外，高的给药剂量也对产品质量提出了更高的要求。为了保证药品安全，很多杂质成分必需降低到极低水平，如宿主DNA，内毒素等；潜在的病毒、泄漏的亲和配基以及抗体的聚集体也必须有效去除，这就要求采用更高效的分离纯化工艺，并对每步工艺去除各种杂质的能力进行深入研究。(2)易形成多种变体抗体是一类结构比较复杂的大分子，比活和稳定性很大程度上取决于其翻译后修饰的程度，如糖基化、磷酸化等。在生产过程中会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等化学反应而产生性质不同的多种抗体变体2；另外，氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径。针对这些变体，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到抗体的稳定性；另外，应严格控制细胞培养的条件，如溶氧、渗透压等3；同时加快下游分离纯化的速度，最大程度避免抗体在纯化过程中产生变体，保证终产品的均一性和高比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。(3)高附加值作为多种癌症和抗排异的特效药，高纯度的治疗用抗体具有极高的市场价值。因此收率成为抗体生产过程中的重要考量指标。减少不必要的工艺步骤不仅可以提高收率，还能提高生产效率。1基于抗体药物的上述特点，为了提高生产效率，达到严格的产品质量要求，抗体的生产工艺也必须着眼于：高处理速度、高载量，更简单有效！通用电气医疗集团为单抗生产提供了快速高效的完整解决方案（图1），将中空纤维膜过滤技术和高流速高载量的新一代MabselectSuRe亲和层析介质、CaptoAdhere两步层析工艺相结合，成为治疗用抗体生产纯化的趋势4。高密度细胞培养液中空纤维膜微滤一步澄清MabSelectSuRe捕获病毒灭活与去除CaptoAdhere精细纯化50K膜包浓缩/洗滤（换缓冲液）0.22uNFF除菌过滤注射用抗体图1治疗用单抗的一般生产工艺流程MabselectSuRe亲和层析介质采用改造过的新型SuRe配基，可以耐受0.1-0.5MNaOH的反复在位清洗5。可以避免抗体产品批间交叉污染，显著降低内毒素水平，也有利于延长层析介质寿命，降低CIP/SIP的成本。R.Hahn6发现，与其他蛋白A亲和层析介质相比，MabselectSuRe具有无可比拟的稳定性，配基脱落最少，寿命最长，宿主蛋白HCP的残留比玻璃基架的蛋白A介质低10倍以上。MabselectSuRe和CaptoAdhere采用高流速琼脂糖骨架，专为大规模层析柱的装填而设计，可以在高流速下仍保持高动态载量和较低的反压，尤其适于自动装填大规模层析柱以快速处理上万升细胞培养液，如图2。2图2大型工业层析柱的自动化填装2.中空纤维膜分离技术2.1切向流过滤技术简介膜过滤技术，又称膜分离技术，是采用具有一定孔径的高分子聚合物，根据体积大小对不同的物质进行筛分的物理分离手段。膜分离技术在生物药物生产过程中扮演着重要角色，尤其近二十年来，膜分离技术发展迅速，不断出现新的膜结构、材质以及操作方式，以满足生物制药日益增长的需求。切向流技术（TangentialFlowFiltration,TFF）又称错流过滤（Cross-FlowFiltration，CFF），其操作原理如图3：料液以一定的流速在膜表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现不同物质的分级分离。5，料液/缓冲液补料口4，Permeate（透过端）压力表3，Retentate（回流端）压力表2，Feed（入口端）压力表1，料液储罐3图3切向流过滤示意图切向流过滤膜按孔径可分为超滤膜和微滤膜：孔径较小的超滤膜常用于蛋白质的浓缩；而孔径较大的微滤膜(如0.45μ)常用于培养液中细胞和细胞碎片的去除，实现层析前料液的澄清。由于切向流过滤技术引入了平行于过滤膜表面的切向流速(Crossflow)，在过滤过程中对膜表面不断进行冲刷，一定程度上可以缓解浓度极化层(ConcentrationPolarizationLayer)和滤饼(FilterCake)的形成，从而降低过滤阻力(FiltrationResistance)，提高单位膜面积的处理量和过滤速度。2.2中空纤维膜分离技术中空纤维膜采用切向流过滤的方式，其膜组件结构如图4所示：一定孔径的膜(如0.45μ)制成纤维状的膜管结构，细胞培养液在膜管的内部流过形成切向流，目标抗体透过膜孔，而细胞和细胞碎片被截留，收集透过端(permeate)即得到澄清的培养液。图4中空纤维膜开放式的流道结构RobertvanReis等人早在90年代初就进行了0.2μ中空纤维膜澄清CHO细胞培养液生产rt-PA的研究8，并放大到180平方米的中空纤维膜系统处理12,000L细胞培养液，澄清收率99%，每平米膜每小时平均处理速度达27升。此外，细胞培养液在处理前后，总细胞密度4收率为102±18%，细胞活率(viability)降低仅7%。这表明中空纤维膜的低剪切力有利于保持细胞的完整性，操作过程中并不会打碎细胞，避免胞内杂质的释放。中空纤维膜低剪切力的特点也广泛用于病毒类大分子的浓缩和澄清，可以有效保护病毒分子的完整性，如采用0.65μ中空纤维滤膜澄清酵母裂解液生产HPV疫苗9；750k中空纤维膜浓缩MDCK细胞流感病毒培养液，同时有效去除宿主DNA等10,11。无血清悬浮培养的动物细胞(如CHO细胞)将单抗分泌到培养液上清，培养液中含有大量细胞和细胞碎片。传统方式采用高速离心结合死端过滤，或是多级的死端过滤经过“粗滤-精滤”等不同的过滤阶段去除固体颗粒物质。但对于几千升乃至上万升的细胞培养液，传统操作方式的弊端也非常明显：大型连续流高速离心机的设备非常昂贵，而转子的日常维护成本更使企业不堪重负；离心后的料液还必须再经过0.2~0.45μ死端过滤才能将小的细胞碎片完全除去，增加了操作步骤和成本。而多级死端过滤工艺的滤芯成本非常昂贵，上游料液性质的波动也会显著影响死端过滤的效能，工艺耐用性不好。中空纤维膜具有开放式管状流道，容尘量高，不易堵塞。细胞培养液可以不经过任何预处理直接用中空纤维膜进行一步澄清，简化了操作步骤，降低了成本。2.3膜分离术语剪切力(Shearforce,1/sec)=4Q/nπr3。Q–feed进样流量(m3/sec),n–中空纤维管的根数,r–中空纤维管的内径(m)剪切力(Shear)是切向流速的另一种表达方式，剪切力和切向流速成正比，和纤维管的内径和纤维管的数量成反比。剪切力越大，流体对膜表面冲刷能力越强。透膜压力（TMP，transmembranepressure，psi磅每平方英寸)=(PF+PR)/2-PPPF(psi磅每平方英寸；bar巴):Feed(入口)压力PR(psi磅每平方英寸；bar巴):Retentate(回流端)压力PP(psi磅每平方英寸；bar巴):Permeate(透过端)压力透膜压力(TMP)是膜两侧的压差（ΔP），是过滤的推动力。根据流体力学，切向流过滤膜内侧压力沿着膜表面流道逐渐降低(PFPR)，从而导致TMP沿着流道也逐渐降低。透过通量(Flux,LMH,L/m2/hr)：单位时间单位膜面积的过滤速度，可以直接利用小试Flux数据作为线性放大后所需膜面积或操作时间的依据。膜载量(Capacity,L/m2)：单位膜面积在规定时间内所能处理的料液量，表征膜的处理能力。对于细胞培养液的澄清，膜载量还要考虑操作过程中因膜逐渐堵塞而导致膜对抗体的截留。因此一定操作条件下膜的载量可以理解为：在保证抗体通透性的前提下，规定的操作时间内所能处理的料液体积。剪切力(切向流速)和透膜压力是非常重要的操作参数，需要在实验过程中进行优化，以达到最佳的透过通量和膜载量！2.4过滤理论5中空纤维微滤膜进行细胞培养液的澄清，需要使目标抗体能够透过膜，而细胞和细胞碎片等颗粒被充分截留。过程评价主要指标包括：处理速度(Flux)、膜载量(Capacity)和收率。如图5所示：切向流微滤过程中，培养液中的细胞和碎片等固体颗粒会倾向于在膜表面沉积，形成厚度为Lc的动态的滤饼层(FilterCake)。动态的滤饼层会产生额外的传质阻力使部分抗体截留，因此在滤饼层表面产生厚度为δ的浓度极化层(ConcentrationPolarizationLayer)，形成抗体分子的浓度梯度。图5切向流微滤过程中膜表面滤饼层和浓度极化层示意图根据过滤理论12，Flux可表示为：Flux=ΔP/μRt=TMP/μRt,(1)其中ΔP为过滤的推动力，μ为料液黏度，Rt为总的过滤阻力。总过滤阻力(Rt)等于各部分过滤阻力之和：即Rt=Rc+Rp+Rif+Rm，其中Rc为滤饼层阻力，Rp为浓度极化层阻力，Rif为膜内部堵塞所产生的阻力，Rm为洁净的膜本身的过滤阻力。对于开放式的微孔滤膜进行细胞培养液的澄清，滤饼阻力Rc为主要阻力，其他阻力项基本可以忽略不计。滤饼层阻力13Rc=αav×wc=αav×ρs(1−εav)Lc(2)其中αav–滤饼的比过滤阻力（m/kg），ρs–滤饼密度（kg/m3）,εav–滤饼平均孔隙率，Lc–滤饼厚度(m)(2)式中，αav和εav可以表示为ΔP的函数。增加剪切力（切向流速）可以增强流体对膜表面滤饼的冲洗能力，使滤饼厚度Lc下降，从而降低过滤阻力，增加Flux，减轻膜堵塞的程度。增加过滤压力ΔP会导致滤饼被压缩，因而比过滤阻力αav增加，滤饼孔隙率εav降低，同时压力增加使更多固体颗粒倾向于在膜上沉积，因此滤饼厚度Lc也相应增加，导致过滤阻力增加。过滤阻力的增加往往会超过推动力ΔP的增加，最终导致透过通量降低，膜容易堵塞，影响抗体的通透性。6所以，为了避免中空纤维膜堵塞，改善膜的透过通量Flux，需要尽可能提高剪切力shear(切向流速)，并降低过滤压力。除透过通量外，还必须考虑抗体的通透性以保证抗体收率。如图5，抗体须经过浓度极化层到达滤饼表面，然后透过滤饼才能最终透过膜。然而滤饼表面的部分抗体可能被切向流冲刷带走而无法有效透过。因此定义冲刷因子（φ）为滤饼表面被切向流带走的抗体的分数。显然，剪切力越高，φ值越大，能够进入滤饼的抗体越少。滤饼的过滤阻力或冲刷因子增加到一定程度，抗体分子的通透性降低，表现为膜对抗体分子的透过产生排斥。膜对抗体的排斥程度可以用Rrej来表示：Rrej=1-Cp/Cb(3)Rrej越大，膜透过液中抗体浓度Cp越低，膜总阻力越大，对抗体的排斥程度就越严重。增加过滤压力ΔP，滤饼会被压缩，单位厚度滤饼对抗体的通透性降低，导致Rrej增加。增加剪切力，可以降低滤饼厚度减少阻力，改善抗体通透性；但剪切力增加到一定程度后，冲刷因子的增加占