生物抗氧化剂清除自由基活性的研究

2015年6月第6期（总第199期）轻工科技LIGHTINDUSTRYSCIENCEANDTECHNOLOGY食品与生物1前言自由基，在化学上也被称作“游离基”，是含有一个不成对的电子的原子团。体内的活性氧自由基具有一定的功能，但过多的活性氧自由基会有破坏作用，导致人体正常细胞和组织损坏，从而引起多种疾病，例如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等。另外，外界环境中阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使得人体产生更多的活性氧自由基，这就是人体衰老和患病的根源。自由基清除剂[1]能借助键的均裂，释放出体积小、亲合性很强的氢自由基，被油脂自动氧化链式反应生成的自由基俘获而生成分子态化合物，将高势能的极活泼的自由基转变为较稳定的分子，从而中断了链式反应的传递速度，阻止了油脂被进一步氧化。随着人们生活水平和物质文化的不断提升，人们更倾向于选择安全性高的天然食品防腐剂，因此选用了红景天提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物对其自由基清除活性进行了试验，希望通过此次研究可以为它们在天然抗氧化剂方面的开发应用提供参考。2实验方法2.1DPPH·法清除自由基活性的方法2.1.1实验原理DPPH·法操作非常简单，不用复杂的检测仪器，是用反应体系颜色的改变来评价试样抗氧化，DPPH·法被很多实验室用作抗氧化剂的抗氧化能力评价方法。DPPH·是一种比较稳定的自由基。DPPH·反应可能是ET机制[2]，也可能是HAT机制[3]，或者是两者共同作用的结果。空间位阻效应是决定DPPH·反应的重要因素，DPPH·反应比较难与空间位阻大的抗氧化剂发生反应，与空间位阻小的抗氧化性的反应机制可能不同，反应达到平衡所用的时间也比较长。自由基因为异常的活泼，并且寿命比较短，所以一般实验方法产生的自由基基本上不可以被精准的量化测量，但是如果根据自由基产生的后果，例如说氧化还原产物或者相关的指标的数据能够反向推导出自由基产生和它被清除、抑制的效果。作为自由基捕捉剂的1，1-二苯基-2苦基肼（DPPH·）在电子顺磁共振检测中自身就能够产生氮自由基，也能够与抗氧化剂产生反应，DPPH有特殊的紫色，与抗氧化剂的作用情况能够从褪色情况反映。2.1.2实验试剂与设备2.1.2.1实验试剂（1）DPPH：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-pic-rylhydrazylradical2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydra-zyl）分子式：C18H12N5O6分子量：394.32暗紫色大棱柱形晶体。mp127～129度（分解）。一般试剂含量不小于98％。（2）磷酸盐缓冲液（PBS）：称取量NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4⋅12H2O3.63g、KH2PO40.24g，用900mL双蒸水溶解，加盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。2.1.2.2实验设备分光光度计。2.1.3实验方法吸取红景天提取物溶液2.0mL，加入2.0mL的0.2mmol/LDPPH·溶液，混合均匀后放置一段时间。用无水乙醇调零，在517nm波长下测定吸光度（A样品），测定2.0mL红景天提取物溶液和2.0mL无水乙醇混合液的吸光度（A对照）。最后测定2.0mL无水乙醇和2.0mLDPPH·溶液在517nm处的吸光度（A空白）。清除率的计算：DPPH·清除率/%=（1-A样品-A对照A空白）。2.2邻二氮菲-F2+e还原法2.2.1实验原理过氧化氢产生的羟基自由基将邻二氮菲-Fe2+溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+后，它在510nm处最大吸收峰消失；加入抗氧化剂溶液后，因为抗氧化剂溶液具有消除羟基自由基的作用，所以使在510nm处的吸光度升高，这种变化反映了抗氧化剂的抗羟基自【第一作者】徐超（1982-），女，广西柳州人，助理工程师，研究方向：产品质量监督。生物抗氧化剂清除自由基活性的研究徐超（广西玉林市质量技术监督局，广西玉林537000）【摘要】人体内自由基的产生与上百种疾病有着密切的联系，除正常代谢外，生存环境与生活方式中有大量促自由基产生的因素，可导致脂质、蛋白质和DNA的氧化性退化、激活致癌原、抑制胞内抗氧化防御系统等。因此，有必要寻找安全有效的生物抗氧化剂补充人体从食物中所摄取的抗氧化维生素的不足。此次研究分别用DPPH⋅法、邻二氮菲-Fe2+还原法测定红景天提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物的清除自由基和抗氧化活性，研究发现DPPH⋅法、邻二氮菲-Fe2+还原法均可以用于红景天提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物抗氧化性能力的测定。在一定的浓度范围内，随着样品提取物溶液浓度的提高，其抗氧化性、清除自由基的能力也相应提高。【关键词】DPPH⋅；邻二氮菲-F2+e；红景天提取物；葛根提取物；葡萄籽提取物【中图分类号】Q617【文献识别码】A【文章编号】2095-3518（2015）06-15-03152015-06-1116:28由基氧化作用。2.2.2实验试剂与设备2.2.2.1实验试剂（1）磷酸盐缓冲液称取量NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4⋅12H2O3.63g，KH2PO40.24g，用900mL双蒸水溶解，加盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。（2）邻二氮菲，硫酸亚铁，去离子水，双氧水。2.2.2.2实验设备分光光度计，保温箱。2.2.3实验方法（1）吸取1.5mL的5mM邻二氮菲，加入4.0mL的150mM，pH=7.4的磷酸盐缓冲液，充分混匀后再加入1.0mL的7.5mM硫酸亚铁，立即混匀后加入2.5mL的去离子水，最后加入1%双氧水1.0mL。至于37℃的保温箱种60分钟后取出，在536nm波长处测定吸光度为A1。（2）吸取1.5mL的5mM邻二氮菲，加入4.0mL的150mM，pH=7.4的磷酸盐缓冲液，充分混匀后再加入1.0mL的7.5mM硫酸亚铁，立即混匀后加入2.5mL的红景天提取物溶液，最后加入1%双氧水1.0mL。至于37℃的保温箱种60分钟后取出，在536nm波长处测定吸光度为A2。（3）吸取1.5mL的5mM邻二氮菲，加入4.0mL的150mM，pH=7.4的磷酸盐缓冲液，充分混匀后再加入1.0mL的7.5mM硫酸亚铁，立即混匀后加入3.5mL的去离子水。至于37℃的保温箱种60分钟后取出，在536nm波长处测定吸光度为A3。2.2.4清除率的计算[4]清除率/%=A2-A1A3-A1×1002.3生物抗氧化剂的配制量取50%乙醇，分别溶解样品提取物[5]（红景天提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物），分别配制成0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的红景天提取物溶液，1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL的葛根提取物溶液，0.1mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL葡萄籽提取物溶液。3结果与分析3.1红景天提取物清除自由基活性的研究3.1.1DPPH·法分别配制了不同的浓度的红景天提取物溶液，当红景天提取物浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL时，测量的吸光度及相应的清除率如图1。从图1可以看出清除率与红景天浓度的关系，红景天提取物浓度在0.1mg/mL至0.6mg/mL与清除率呈正相关，并且在0.1mg/mL至0.5mg/mL的浓度范围内有比较好的线性关系。超过0.5mg/mL后，即使红景天提取物浓度溶液的浓度增加，清除率提高不大，而且当红景天提取物溶液浓度大时，样品的吸收效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和准确度都不高，但是当清除率小于25%测定结果的绝对误差大，据此活性测定浓度范围在0.2mg/mL至0.5mg/mL，清除率在38%至83%。图1红景天提取物清除自由基活性的研究3.1.2邻二氮菲-Fe2+还原法分别配制了不同的浓度的红景天提取物溶液，当红景天提取物浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL时，测量的吸光度及相应的清除率如图2。从图2可以看出，邻二氮菲-Fe2+还原法测定的清除率与红景天浓度的关系，红景天提取物浓度在0.1mg/mL至0.6mg/mL与清除率呈正相关，并且在0.2mg/mL至0.6mg/mL的浓度范围内有比较好的线性关系。当红景天提取物溶液浓度大时，样品的吸收效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和准确度都不高，但是当清除率小于25%测定结果的绝对误差大，据此活性测定浓度范围在0.4mg/mL至0.6mg/mL，清除率在36%至72%。图2红景天提取物清除自由基活性的研究3.2葛根提取物清除自由基活性的研究3.2.1DPPH·法分别配制了不同的浓度的葛根提取物溶液，当葛根提取物浓度分别1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL时，测量的吸光度及相应的清除率如图3。从图3可以看出，DPPH·法测量的清除率与葛根浓度的关系，葛根提取物浓度在1mg/mL至25mg/mL与清除率呈正相关，并且在5mg/mL至20mg/mL的浓度范围内有比较好的线性关系。超过20mg/mL后，即使葛根提取物浓度溶液的浓度增加，清除率提高不大，而且当红景天提取物溶液浓度大时，样品的吸收效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和准确度都不高，但是当清除率小于25%测定结果的绝对误差大，据此活性测定浓度范围在5mg/mL至20mg/mL，清除率在32%至79%。01020304050607080901000.10.20.30.40.50.6红景天浓度（mg/mL）自由基清除率（%）010203040506070800.10.20.30.40.50.6红景天浓度（mg/mL）自由基清除率（%）16图3葛根提取物清除自由基活性的研究3.2.2邻二氮菲-Fe2+还原法分别配制了不同的浓度的葛根提取物溶液，当葛根提取物浓度分别1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL时，测量的吸光度及相应的清除率如图4。从图4可以看出，邻二氮菲-Fe2+还原法测量的清除率与葛根浓度的关系，葛根提取物浓度在1mg/mL至25mg/mL与清除率呈正相关，并且在1mg/mL至20mg/mL的浓度范围内有比较好的线性关系。超过20mg/mL后，即使葛根提取物浓度溶液的浓度增加，清除率提高不大，而且当葛根提取物溶液浓度大时，样品的吸收效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和准确度都不高，但是当清除率小于25%测定结果的绝对误差大，据此活性测定浓度范围在5mg/mL至20mg/mL，清除率在36%至70%。图4葛根提取物清除自由基活性的研究3.3葡萄籽提取物清除自由基活性的研究3.3.1DPPH·法分别配制了不同的浓度的葡萄籽提取物溶液，当葡萄籽提取物浓度分别为0.1mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL时，测量的吸光度及相应的清除率如图5。从图5可以看出，DPPH·法测量的清除率与葡萄籽提取物溶液浓度的关系，葡萄籽提取物溶液浓度在0.1mg/mL至15mg/mL与清除率呈正相关，并且在1mg/mL至10mg/mL的浓度范围内有比较好的线性关系。超过10mg/mL后，即使葡萄籽提取物溶液浓度的浓度增加，清除率提高不大，而且当葡萄籽提取物溶液浓度大时，样品的吸收效应使背景加深影响测定，使在这个浓度区间测量的灵敏度和准确度都不高，但是当清除率小于25%测定结果的绝对误差大，据此活性测定浓度范围在2mg/mL至10mg/mL，清除率在43%至65%。图5