第五讲基因定点诱变PCR技术

M.Smith（加拿大生物化学家）1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。利用寡核苷酸定点诱变技术，可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。寡核苷酸定点诱变技术基因诱变的应用1结构和功能2基因的注释3代谢途径-分子育种4蛋白质的修饰5分子设计-分子进化工程缺失诱变1简单缺失通过对DNA片段中具有的相应的酶切位点进行切割，而后用T4连接酶进行连接。2系统缺失核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段插入突变1人工合成片段2Transposoninsertion（Tn5）3同源重组4PCR基因的体外诱变Kunkel法或称”U”法dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下有“T”占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶E.Coli（dut-，ung-）合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。CJ236(dut-，ung-，F+)ssDNA制备载体1单链噬菌体载体M132phagemid载体-辅助噬菌体所用酶类T4噬菌体聚合酶：诱变几率65%T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持续合成DNA的能力强，遇到引物时会停止。诱变几率83%KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链时，可能会替换。诱变几率36%影响因素1引物：热动力学（配对），突变碱基的左右8-10bp2T4连接酶35’端磷酸化4单链结合蛋白：解决颈环结构基因扩增（geneamplification）主要内容：1.体外扩增2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增PCR技术在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。ParameterConcentrationTemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+oncentrationEnzymeTotalvolume10attomoles(~1×106molecules)8.4（10mMTris-Hcl）200μM(eachone)100g/ml(optional)0.5μM(eachone);(0.1—1.0μM)0.5mM10mM1unit25—100μlReactionConditionforaTypicalPCRAssayTypicalPCRThermalProfileProgram94℃(firststep)37—60℃(secondstep)72℃(thirdstep)RepsCycle1Cycle2—30Cycle31*1min1min1min1min1min1min1min1min10min1×29×1×*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllengthEnzymeMicrobialSourceThermotoleranceKlenowSequenaseTaqBstEPfuTthUlTmaEscherichiacoliT7bacteriophageThermusaquaticusBacillusstearothermophilusPyrococcusfuriosusThermusthermmophilusTeratogamaritimaNoNoYesYesYesYesYesSomeDNAPolymerasesUsedinPCRCharacteristicsDescriptionOriginMolecularweightOptimaltemperatureActivityStabilityFidelityMg2+concentrationExonucleaseactivityTransferaseactivityThermusaquaticusstrainYT194kd72--80℃150nucleotides/sec/molecule50%at95℃for40min1.1×10-4substitutionspercycle0.5mM10mM5’to3’only5’adenosinesCharacteristicsofTaqPolymerasePCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。2.简并引物atggctant…3.嵌套引物PCR扩增的长度：2kbPCR技术的应用：1.基因组克隆突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。反相PCR(reversePCR)与染色体步移不对称PCR(asymmertricPCR)用来制备单链的DNA特点：两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素—链霉素包裹的磁珠）