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实验四微生物平板菌落计数法一、实验目的学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。二、实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。三、实验器材1．菌种：酵母菌。2．培养基：YEB培养基。3．仪器或其他用具：1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。四、实验步骤1．编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6（稀释度）各2套，另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀释用1ml无菌吸管吸取1ml已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液1ml，精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。······其余依次类推。放菌液时吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。3．倒平板法：1）取样。用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。2）倒平板。尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的LB培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。3）待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养基中培养。4.涂布法：涂抹平板计数法与倒平板法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。5．计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适，同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复三个对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5和10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。五、实验结果将培养后菌落计数结果填入下表：稀释度10-410-510-6123平均123平均123平均Cfu数/平板每毫升中的cfu数六、思考题（1）为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？（3）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。（4）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？（5）用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？