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1Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不2能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNaseІ（Promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。RNADNaseІ10xbufferH2O(RNasefree)RNasin30201039.50.5µlµlµlµlµl总体积100µl然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15min；4）4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清；5）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1）纯度检测：取1μlRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2）总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA，18srRNA和28srRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1.mRNA：1)在RNasefree的PCR管中配置下列溶液.32)将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；3)在该PCR管中加入下列试剂（Promega）oligo（dT）Randomprimer10mMdNTPRNaseinhibitor5xbufferM-MLV0.50.52.00.54.00.5µlµlµlµlµlµl总体积8.0µl4)将上述20μl反应溶液30℃保温10min；5)42℃保温50min；6)85℃保温10min；7)-20℃保存。2.microRNA：使用茎环逆转录法，原理如下图：TotalRNAH2O1.0µgµl总体积12µl41）在去RNase的PCR管中配置以下溶液.2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mMdNTP(promega)RNaseinhibitor(promega)U6逆转录引物5xbufferM-MLV(promega)2.00.50.54.00.5µlµlµlµlµl总体积7.5µl4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30℃保温10min；5）42℃孵育50min；6）85℃孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1.引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2．确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板totalRNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*Xµgµl总体积12.5µl53．正式实验：体系配制：H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul(TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul（10uM）下游引物0.5ul（10uM）总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份--1份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。3．cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。）4．把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五．上机：5.1先开电脑，进入Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开7500软件，选择“新建”，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”（普通基因检测为“60”，MicroRNA检测为“65”）5.3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。5.4点击File菜单中Save，输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5点击Start键，开始运行程序。5.6程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭ABIPRISM75006SDS软件、PCR仪电源开关。5.7在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。（同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃）