试验九免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架

免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架实验九实验目的与要求1.掌握免疫荧光技术的基本原理;2.了解免疫荧光技术在生命科学中的广泛应用.一、实验的基本原理荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。三、试剂与器材人肿瘤细胞涂片甲醇、H2O2、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、FITC标记的IgG、甘油/PBS封片剂、盖玻片荧光显微镜玻片细胞置于甲醇中-10℃固定5min，室温凉干（或冷丙酮固定5min，室温凉干）；PBS漂洗2min×3次；3%H2O2室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物酶活性）；PBS漂洗5min×3次；10%正常羊血清封闭液（0.1MPBS配制）室温封闭20min；弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）；四、实验步骤用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:200）37℃孵育1h（或4℃孵育过夜）；PBS漂洗5min×3次；用适当比例稀释的二抗（FITC标记的IgG）（一般稀释比为1:100-1:200，用加有BSA的TBS－T配制）室温孵育30min（避光黑暗条件下进行）；PBS漂洗5min×3次；甘油/PBS封片剂（PBS:甘油=1：9，v/v，pH8.0-8.5）封片；荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察拍照。五、注意事项1.注意各级抗体浓度的使用范围;2.荧光抗体孵育时要注意避光;3.注意各步骤的漂洗要充分.六、作业与思考题试述免疫荧光技术的基本原理,并描述实验中所观察的实验现象.思考题:试比较免疫荧光技术与免疫细胞化学技术的异同.