1-细胞生物学实验技术

细胞生物学实验技术2020/4/111前言细胞生物学英文名称：cellbiology定义：从细胞整体、显微、亚显微和分子等各级水平上研究细胞结构、功能及生命活动规律的学科。发展：细胞生物学由Cytology发展而来，它是关于细胞结构与功能(特别是染色体)的研究。现代细胞生物学从显微水平，超微水平和分子水平等不同层次研究细胞的结构、功能及生命活动。2020/4/112细胞生物学发展简史：显微水平超微水平分子水平三个层次：洋葱表皮细胞显微结构骨骼肌超微结构脱氧核苷酸结构模型2020/4/113四个阶段：从16世纪后期到19世纪30年代，是细胞发现和细胞知识的积累阶段。通过对大量动植物的观察，人们逐渐意识到不同的生物都是由形形色色的细胞构成的。第一阶段RobertHooke（1636～1702），1665年，他在《显微图谱》中第一次使用“细胞”一词。2020/4/114Hooke观察到的软木结构Hooke使用的显微镜从19世纪30年代到20世纪初期，细胞学说形成后，开始了在显微水平研究细胞的结构与功能。形态学、胚胎学和染色体知识的积累，使人们认识了细胞在生命活动中的重要作用。•1893年Hertwig的专著《细胞与组织》（DieZelleunddieGewebe）出版，标志着细胞学的诞生。•1896年哥伦比亚大学Wilson编著的《细胞发育与遗传》（TheCellinDevelopmentandHeredity）、1920年墨尔本大学Agar编著的《细胞学》（Cytology）都是这一领域最早的教科书。第二阶段2020/4/115从20世纪30年代到70年代，电子显微镜技术出现后，把细胞学带入了第三大发展时期，这短短40年间不仅发现了细胞的各类超微结构，而且也认识了细胞膜、线粒体、叶绿体等不同结构的功能，使细胞学发展为细胞生物学。DeRobertis等人1924年出版的《普通细胞学》（GeneralCytology）在1965年第四版的时候定名为《细胞生物学》（CellBiology），这是最早的细胞生物学教材之一。第三阶段2020/4/116线粒体结构示意图线粒体超微结构从20世纪70年代基因重组技术的出现到当前，细胞生物学与分子生物学的结合愈来愈紧密，研究细胞的分子结构及其在生命活动中的作用成为主要任务，基因调控、信号转导、肿瘤生物学、细胞分化和凋亡是当代的研究热点。第四阶段2020/4/117细胞凋亡示意图细胞信号转导途径细胞分化示意图细胞生物学学科的发展，正是基于新的研究技术方法的建立。技术方法与科研思路是学科发展的双翼，二者缺一不可。2020/4/118《细胞生物学实验技术》学习内容显微镜技术细胞结构与成分的显示技术细胞生理生化研究细胞培养和分析细胞膜技术2020/4/119细胞周期分析细胞成分的分离与分析细胞工程基础技术细胞凋亡的测定染色体技术分子细胞生物学技术《细胞生物学实验技术》参考书目2020/4/1110章静波,黄东阳,方瑾主编.《细胞生物学实验技术》.化学工业出版社.2006年出版.李芬主编.《细胞生物学实验技术》.科学出版社.2007年出版.印莉萍,祁小廷主编.《细胞分子生物学技术教程》.科学出版社.2001年出版.第一章显微镜技术2020/4/1111普通显微镜的构造及使用方法相差显微镜的构造及使用方法荧光显微镜的构造及使用方法激光扫描共聚焦显微镜的构造及使用方法透射电子显微镜与超薄切片技术扫描电子显微镜与样品制备显微镜分类：光学显微镜：2020/4/1112可把物体放大1500倍，分辨的最小极限为0.2μm。电子显微镜：•分辨率达微米，用于观察组织的显微结构及细胞形态、数量、生长状态等。普通光学显微镜•用于观察活细胞的细微结构。相差显微镜•对能发射荧光的物质进行定性和定量分析。荧光显微镜•可对观察样品进行断层扫描和成像；•可无损伤地观察和分析细胞三维空间结构；•可进行活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记的观察。激光扫描共聚焦显微镜2020/4/1113用高速电子束代替光束，放大倍数达80万倍，分辨率最小极限达0.1~0.2nm。电子显微镜：•把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，形成明暗不同的影像。•对样品密度、厚度有要求，需要50~100nm超薄切片。透射电子显微镜•用聚焦电子束在样品表面逐点扫描成像，可研究物质微观结构（纳米级）。放大倍数可达10~1000000倍，常用于获取细胞或组织表面的立体成像。扫描电子显微镜第一节普通显微镜的构造及使用方法2020/4/1114显微镜的主要部分是物镜和目镜，为两组焦距较短的凸透镜。一、原理与应用2020/4/1115物镜的焦距（F1）短，目镜的焦距（F2）略长。物体AB位于物镜的2倍焦距和1倍焦距之间，所以在物镜的像方形成一个倒立的放大的实像A’B’；A’B’位于目镜的1倍焦距以内，经目镜放大为虚像A’’B’’，A’’B’’位于人眼的明视距离内。A’’B’’的视角比眼睛直接看AB时视角大得多，所以用显微镜可以看清微小的东西，但人眼通过目镜所看到的是被放大了2次的倒立的像。ABA’B’A’’B’’F2F1机械部分照明部分光学部分2020/4/1116二、仪器构造•镜座•镜柱•镜臂•镜筒•物镜转换器•镜台•调节器粗准焦螺旋细准焦螺旋机械部分2020/4/11照明部分•反光镜•聚光器•光圈光学部分•目镜•物镜17（1）目镜通常备有2~3个，上面刻有5×、10×或15×符号，表示放大倍数，一般用10×目镜。2020/4/1118一般有3~4个，上面标有放大倍数和数值孔径（镜口率），如10/0.25、40/0.65和100/1.3；镜筒长度和所要求的盖玻片厚度，如160（mm）/0.17（mm）。（2）物镜表1-1不同倍数物镜的比较2020/4/1119镜头放大倍数镜身数值孔径工作距离/mm低倍镜10×短0.37高倍镜40×较长0.50.5油镜100×长1.30.2不同放大倍数物镜的工作距离（1）材料：•“a”字片、•红绿羊毛交叉片•人血涂片•双层油镜瓶•擦镜纸（2）设备：普通光学显微镜2020/4/1120三、实验用品1、低倍镜子的使用方法：•取镜和放置•对光•放置标本片•调节焦距2020/4/1121四、实验操作看不到物象的可能原因：•物镜未对正通光孔，对正后再观察；•标本未放到视野内，移动标本至通光孔中央；•调节器转动太快，超过焦点，应重新调焦；•视野内光线太强，不易观察到未染色的标本片，将光线调暗再观察。2、高倍镜的使用方法：•选好目标•转换高倍物镜•调节焦距2020/4/11223、油镜的使用方法：•选好目标•转换油镜•调节光亮•调焦•擦净油镜头和标本片2020/4/1123五、注意事项1、轻拿轻放，一手握镜臂一手托镜座；2、显微镜放稳，镜筒倾斜角度不超过45°；3、升镜台、降镜筒、转换物镜时，切勿边操作边观察；4、更换标本片时，使镜台与镜头远离，方可取下标本片；5、观察部位要对准通光孔中央，不能放反；6、转换物镜时应转动转换器，勿手持物镜移动；7、用完后使镜头离开通光孔，下降载物台，竖立反光镜，下降聚光器，关闭光圈，玻片移动器回位，放回镜柜内；8、保持清洁，勿口吹、手抹或用布擦光学和照明部分。2020/4/1124六、实验结果及分析1、低倍镜观察“a”字片呈倒立的物像，且玻片的移动方向与视野内物像移动的方向相反。2、高倍镜观察红绿羊毛交叉片，先在低倍镜下找到羊毛，并将红绿羊毛的交叉点移到视野的中心，然后换高倍镜观察。转动细调节器下降镜台时红色羊毛清晰，表明红色羊毛位于交叉点上方；上升镜台时，绿色羊毛清晰，表明绿色羊毛在交叉点的下方。3、低倍镜、高倍镜、油镜观察人血细胞涂片时，观察范围依次变小，放大倍数、分辨率依次提高。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。其中白细胞主要包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。红细胞为双凹扁盘状,无细胞核，橘红色。白细胞形态不一，细胞核紫色；其中淋巴细胞细胞核大而圆，周围边缘为浅蓝色细胞质；单核细胞，核为马蹄形或肾形，细胞质比例较大浅蓝色；粒细胞核成为叶状，细胞质中具有大小不等的颗粒。血小板为紫红小片状，常多个聚在一起。第二节相差显微镜的构造及使用方法2020/4/1125一、原理与应用2020/4/11光波有振幅(亮度)、波长(颜色)及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置的不同。光波通过物体时波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。活细胞和未经染色的生物标本，波长和振幅并不发生变化，因细胞各部分细微结构的折射率和厚度略有不同，光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，光波的相位发生变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人眼无法鉴别，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜就是将经过透明物体的直射光延迟或提前1/4波长，并和绕射光产生干涉，相位差变为振幅差。如果产生的干涉为相长干涉，则振幅的同相量相加而变大，即可看到较亮的部分；如果产生的干涉为相消干涉，则振幅异相量相消而变小，这部分就变得较暗。变相位差为振幅差的结果，使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，可清晰观察活细胞的细微结构。26在普通显微镜上增加下列四种附件就成为相差显微镜：环状光阑相差物镜绿色滤光片合轴调整望远镜2020/4/1127二、仪器构造123456相差显微镜光路图示1-目镜；2-物镜；3-标本片4-聚光器；5-相板；6-环状光阑2020/4/11•环状光阑环状光阑位于光源与聚光器之间，是环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽与不同物镜相匹配。大小不同的环状光阑成一转盘。更换放大率不同的物镜时，要同时更换相应的环状光阑。其作用是使照明光线从环状的透明区进入聚光镜，再斜射到标本上。•相差物镜(镜头上标有PC或PH字样)物镜的后焦平面上装有相板，相板上和环状光阑相对应的环状部分大多数涂有吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来的光线，绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，一般所用的相板推迟相位1/4波长，吸收80%的直射光，使直射光和绕射光的强度接近，明暗反差增大。由于透明标本内部构造的折射率不同，产生绕射光的相位有不同程度的推迟，绕射光和直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。282020/4/11•绿色滤光片在环状光阑下面置绿色滤光片于光路中，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。一般选用中心波长546nm的绿色滤光镜，滤光镜插入后对比度就提高。•合轴调整望远镜为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上，必须拔出目镜，装上特别的低倍望远镜，使相板的暗环与环状光阑的明环重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，物镜安装在载物台的下方，光源及聚光器安装在载物台的上方。倒置相差显微镜用于观察培养瓶或培养板中的活细胞的细微结构，由于工作距离的限制，最大放大率为60×，一般研究用倒置相差显微镜配置有4×、10×、20×及40×相差物镜。。29（1）材料：体外培养细胞；（2）设备：相差显微镜。2020/4/1130三、实验用品1、倒置相差显微镜的使用方法：(1)打开开关，将标本置于载物台上；(2)转动环状光阑转盘，使普通光阑进入光路，并将光圈开到最大。旋转物镜转换器，使低倍相差物镜进入光路，对光和调焦，看见标本。四、实验操作2020/4/1131(3)转动转换器，使相差物镜(20×)对准标本，同时转动环状光阑转盘选用20×标示孔的光阑，以使环状光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，用细调节器调节焦距，使物像清楚。(4)合轴调节。将合轴望远镜换入目镜筒内，一边向望远镜内观察，一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，将望远镜固定，升降聚光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后前后左右调