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中国中医急症２０１１年４月第２０卷第４期ＪＥＴＣＭ．Ａｐｒ．２０１１，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４·６０７··实验研究·IL-1及TNF-α在关节炎大鼠模型血清中表达的实验研究肖金鱼王炳胜△王书杰解放军第二五一医院（河北张家口075000）中图分类号：R285.5【摘要】文献标志码：A文章编号：1004-745X（2011）04-0607-02目的检测白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在佐剂性关节炎（AA）大鼠模型血清中的水平。方法建立AA大鼠模型，根据X线片及组织病理学的特点证实造模成功。用ELISA法检测AA大鼠模型血清中炎性细胞因子IL-1、TNF-α的水平。结果与对照组大鼠比较，模型组大鼠血清中IL-1、TNF-α水平明显升高。结论模型组大鼠血清中含有大量的IL-1、TNF-α，提示IL-1、TNF-α在类风湿关节炎的发病过程中起着重要作用。【关键词】类风湿关节炎佐剂性关节炎细胞因子白细胞介素-1肿瘤坏死因子-αExpressionofIL-1andTNF-αinAdjuvantArthritisRatsModlesXIAOJin-yu，WANGBing-sheng，WANGShu-jieNo.251HosptalofPLA（Zhangjiakou075000，Hebei）【Abstract】Objective：TodetecttheexpressioncharacteristiceofIL-1andTNF-αinadjuvantarthritis（AA）ratsmodel.Methods：AAratsmodelwasestablished，thetheserumlevelofIL-1andTNF-αweredeterminedbyELISAandthedegreeofpathogenicityaswellasthepathologicalcharacteristicewereassayedbyhistopathologicaltechniquesandjointroentgenography.Results：Comparedwiththecontrolgroup，theIL-1andtheTNF-αwereincreasedobviouslyinthemodelgroup.Conclusion：TheserumlevelofIL-1andTNF-αmightinvolveinthepathogenesisofrheumatoidarthritis.【Keywords】Rheumatoidarthritis；Adjuvantarthritis；Cellfactor；IL-1；TNF-α类风湿关节炎（RA）的典型病理学特征为滑膜组织异常增生，其中细胞因子网络失调持续作用于病变部位是导致病变侵蚀进展的主要原因之一。细胞因子通过介导细胞与细胞之间的相互作用引起组织损伤酶的释放，从而导致关节损伤，是RA炎症和关节损伤的重要介质。其中白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因（TNF-α）在RA滑膜炎及软骨和骨的破坏中起着非常关键的作用［1-2］。本实验基于IL-1和TNF-α的上述特性，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测佐剂性关节炎（AA）大鼠模型血清中1.3模型制备30只大鼠随机分成空白对照组（10只）、模型组（20只），每组雌雄各半。根据文献［3］方法加以改进，正常条件饲养10d后，将弗氏完全佐剂摇匀后，按0.1mL/只将弗氏完全佐剂注于大鼠右后肢足跖内造模。造模20d后取5只大鼠（用苦味酸做标记），每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg待大鼠麻醉后，拍摄大鼠四肢关节X线摄片，观察关节破坏情况。30d后取相同大鼠重复操作，观察关节破环情况。造模30d后取模型组5只大鼠的踝关节，经固定、脱钙石蜡包埋、切片后行苏木精-伊红（HE）染色。光镜下观察局部组织病理学变化。IL-1和TNF-α，以探讨其在动物模型中的表达特点。1材料与方法1.420只wistar大鼠，雌雄各半，体质量（150±30）g，模型评价大鼠生长情况评价：造模前称体质量1次，造1.1实验动物模后每2日测量1次，记录动物生长情况。同时仔细观察动物的毛色、精神状态及关节症状的变化，模型组动物表现为体质量减轻，精神萎靡，带有病态，伴轻微脱毛等。对照组大鼠体质量略有增长，其他方面没有明显明显变化。大鼠关节足肿胀评价：注射弗氏完全佐剂后，用容积法排水法测量双后肢的足肿胀度。造模前观察1次，后每周观察1次，观察足爪肿胀情况。同时对其他合格证号：0172808，购于河北北方学院动物室；饲养条件：SPF动物实验室，全年温度21～24℃，相对湿度40%～67%，换气次数14.4～17.2次/h，空气洁净度6000～12000级，梯度压差19.8～31.6Pa，噪声37.2～45.0dB，菌落数1.0～2.1个/皿，氨浓度3.2～4.5mg/m3。1.2试药与仪器TDL80-2B离心机，EL301stripreader酶标仪3只足爪炎症进行评分。采用4分制的评分标准，每只大鼠的最高分为16分，记录并比较20d时，对照组和造模组关节炎指数和双后肢足肿胀度平均值差异。购于自美国BioTek公司。756MC型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。1.5标本采集10%的水合氯醛以3.5mL/㎏对大鼠进行麻醉，△通信作者开胸使心脏暴露，进行心脏取血，全血2500r/min离心20min，取·608·中国中医急症２０１１年４月第２０卷第４期ＪＥＴＣＭ．Ａｐｒ．２０１１，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４血清-20℃保存备用。检测细胞因子具体操作按ELISA试剂盒说明进行。协调、促进，在多数情况下表现协同性生物学效应，是炎症、组织损伤及免疫反应的主要介质，在类风湿关节炎的发病机制中占重要地位。IL-1和TNF-α可激活血管内皮细胞、增强内皮细胞黏附分子的表达，使血液中的白细胞通过与黏附分子相互作用被汇集到关节腔而诱发炎症。IL-1和TNF-α可促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2和胶原酶，引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解，而局部免疫复合物和游离的胶原等分解产物刺激IL-1和TNF-α的合成，以致形成一个恶性循环。IL-1和TNF-α促进人软骨细胞分泌纤维蛋白溶酶原激活剂，使纤维蛋白溶酶原转换成纤维蛋白溶酶而降解纤维蛋白，加速胶原的分解代谢，这些作用均可造成类风湿关节炎的软骨损伤。IL-1也能抑制胶原及碱性磷酸酶的合成，增加破骨细胞数量及骨吸收面积，刺激纤维母细胞增生，增加破骨细胞活性，促进骨的吸收而致类风湿关节炎骨的破坏［4］。笔者通过对大鼠AA模型的制备及对照组和模型组大鼠关节炎症积分、影像学、病理学等相关指标的评估，进一步探讨了1.622.1统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计。结果以（±s）表示，组间比较采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。结果模型组大鼠与对照组大鼠比较，体质量明大鼠一般情况显减轻，模型组关节表现为红、肿、以对称性后肢关节为主，累及踝关节、膝关节、趾间关节等。20d左右出现第1个炎症高峰后红肿有一定程度消退；30d达到第2个高峰，进入慢性期，红肿逐渐消退逐渐出现关节强直、畸形以至功能障碍，表明慢性、对称性、多发性关节炎发生。2.2两组大鼠双后肢足肿胀度比较实验第14日，大鼠关节开始出现肿胀，而后足首先出现红肿，后逐渐延伸至前足并日趋严重，20d肿胀达到最高值后逐渐减轻，模型组与对照组大鼠比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。表1组别对照组模型组两组大鼠双后肢足肿胀度比较（±s)n1010关节炎指数关节体积（cm3）IL-1和TNF-α在AA模型中的表达特点。本实验结果表明IL-1和TNF-α大鼠模型大量增长与表达，这与其在RA患者中的相关表达特点相类似，说明在AA造模过程中IL-1和TNF-α发挥了重要作用。作为在RA中大量存在的T细胞来源的细胞因子0.90±0.737.29±1.82*7.15±0.2313.81±1.63*与对照组比较，*P0．05。下同。2.3大鼠双后肢X线表现X线片显示模型组大鼠以双后肢IL-1和TNF-α可能成为评价RA病情和治疗疗效的两个最重要免疫学指标。总之，对IL-1和TNF-α的深入研究必将有助于对改变为主，20d时隐约可见骨质疏松，关节间隙模糊，30d时可见明确的关节间隙模糊、变窄。而对照组大鼠双踝关节同时点比较，变化不大，无明显骨质疏松、关节间隙清晰、未见骨质破坏。RA发生机制的进一步认识，合理地评价RA的病情进展，为RA治疗，包括药物及免疫治疗提供更加科学的实验依据。参［1］考文献2.4大鼠炎性足爪组织病理学改变造模30d后，模型组大鼠节腔滑膜层次增多可达6～8层，甚至十余层且排列不规整，滑膜内有大量炎性细胞浸润，以单核细胞和淋巴细胞为主，且在关节软骨附近有血管翳形成，引起关节软骨和骨组织破坏。StrandV，KavanaughAF.Theroleofinterleukin-1inboneresorp-tioninrheumatoidarthritis［J］.Rheumatology，2004，43（Suppl3）：220-226.2.5大鼠外周血IL-1和TNF-α的表达模型组IL-1和TNF-［2］ZwerinaJ，HayerS，Tohidast-AkradM，etal.Singleandcombinedin-hibitionoftumornecrosisfactor，interleukin-1，andRANKLpathwaysintumornecrosisfactor-inducedarthritis：effectsonsynovialinflam-mation，boneerosion，andcartilagedestruction［J］.ArthritisRheum，2004，50（1）：277-290.α较对照组均明显升高，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。表2两组大鼠炎性细胞因子水平比较（ng/L，±s)组别对照组模型组［3］n1010IL-1109.40±9.81228.46±29.62*TNF-α148.43±15.19220.68±20.62*DelwigA，AltmannDM，IsaacsJD，etal.TheimpactofglycosylationonHLA-DR1-restrictedTcellrecognitionoftypeIIcollageninamousemodel［J］.ArthritisRheum，2007，54：482-491.［4］YinT.InvolvementofIL-6signaltransducergp130inIL-11-mediat-edsignaltransduction［J］.JImmunol，1993，15（3）：2555-2561.3讨论IL-1和TNF-α主要由单核细胞及巨噬细胞分泌，二者相互（收稿日期2010-11-21）(上接第565页)阴增液，通利膈咽。方用麦门冬汤合益胃汤加减。药用沙参、麦冬、法半夏、白芍、陈皮、甘草、蒲公英、木蝴蝶、麦芽。若阴伤较重，病史较久，则用一贯煎加味；若大便干结难解，则加瓜蒌仁、火麻仁；夜寐不安加酸枣仁、夜交藤；疼痛较著，则加金铃子散、失笑散；呃逆呕吐，则合橘皮竹茹汤。嗳气，稍有反酸，胃脘隐痛，进食辛、酸、酒类刺激性饮食症状发作或加重，口干，食欲减退，睡眠欠佳，大便偏干，苔薄黄，脉细弦。胃镜示反流性食管炎证属肝郁脾虚，治以疏肝通降，益气健脾。药用太子参10g，炒白术10g，黄芩10g，仙鹤草15g，炒枳壳10g，陈皮6g，白芍15g，木蝴蝶2g，莪术6g，决明子15g，百合15g，夜交藤15g。服药21d后，诸症明显缓解，胃脘胀痛基本消失。4病案举例宋某，男性，57岁，2010年9月日门诊。刻下：胃脘时有作胀，（收稿日期2010-11-09）