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环境微生物学环境与公共卫生学院第3章微生物的生长与代谢第三节环境微生物的生长繁殖1.微生物纯培养技术2.微生物的生长繁殖(1)分离(2)培养(3)纯培养的保存与复壮一、微生物纯培养的概念实验室条件下，由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。二、微生物纯培养技术纯培养基本步骤：(2)培养(1)分离无菌技术分离、纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术，它是保证微生物学研究正常进行的关键。接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。•用固体培养基分离纯培养不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基(用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基)，可使每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。稀释倒平板法涂布平板法平板划线分离法单细胞挑取法纯培养方法1.稀释倒平板法待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法：基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯度稀释过程10-110-210-310-410-510-64)操作要点：无菌操作稀释平板分离法使用过程中的几个问题1)梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量2)选择菌落接种的依据：a、菌落特征；b、菌体的特征3)微生物纯培养的标准：菌落特征一致性2.涂布平板法在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。二、微生物纯培养技术•3.平板划线分离法用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。二、微生物纯培养技术平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）4、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。二、微生物纯培养技术•单细胞(单孢子)分离采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。三、目标微生物纯培养筛选的基本思路１、待分离样品的确定２、培养基的选择３、纯化过程环境条件的控制（温度、空气、PＨ、抑制剂）（Ｐ１３８－１４１）（一）纯培养的保存试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气四、纯培养的保存与复壮1、灭菌彻底2、棉塞大小要合适3、无菌操作保存过程的注意点：防止杂菌污染。通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义。•传代培养保藏常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种。传代培养十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化。（二）纯培养的衰退与复壮四、纯培养的保存与复壮衰退的原因：衰老、变异衰退的表现：生长缓慢优良性状的丧失抗逆性下降衰退的预防：控制继代频率创造良好的培养条件采取有效的保存方式复壮狭义（被动）广义（主动）复壮方法：选优汰劣微生物生长的指标(生物量的测定)细胞群体数量的增加细胞群体总重量增加从群体水平上衡量(间接的测定方法)微生物的生长繁殖细菌的个体生长细菌的群体生长繁殖•微生物生长繁殖微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。•细菌的个体生长细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制：1.染色体DNA的复制和分离2.细胞壁扩增3.细菌的分裂•细菌的群体生长繁殖细菌接种到均匀的液体培养基后，在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间里细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线。一、微生物生长量的测定微生物生长量的测定微生物数量的测定显微镜直接计数法稀释平板计数法最大概率法比浊法称重法含N量测定法DNA含量测定法ATP含量测定法代谢活性法微生物重量的测定(一)微生物数量的测定1、显微镜直接计数法使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。优点：操作简便，计数直观。一、微生物生长量的测定•直接计数这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数(一)微生物数量的测定2、稀释平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：传统计数方法。对设备要求不高。一、微生物生长量的测定10-310-510-410-6此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数3.平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作(一)微生物数量的测定３、比浊计数法根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。优点：简便，直接。一、微生物生长量的测定(二)微生物重量的测定1、称重法用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。优点：简单可靠。一、微生物生长量的测定在活性污泥法中采用的指标：（1）混合液悬浮固体(MLSS)（粗放测定）污泥—干燥----称重(W1)（2）挥发性悬浮固体(MLVSS)（相对准确）上述已称重污泥-----马福炉(500度2小时)----冷却---称重(W2)(二)微生物重量的测定2、含氮量测定法根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。一、微生物生长量的测定原理：（1）微生物蛋白质含量稳定（2）氮是蛋白质的稳定成分(蛋白质量=6.25×总含N量)优点：测定准确。二、细菌分批培养群体生长规律分批培养：将少量的细菌接种到一定体积的液体培养基中，在适宜的条件下培养，最后一次性收获的过程。生长曲线：细菌在新的适宜的环境中生长、繁殖、衰老、死亡的动态变化。㏒细胞数延滞期指数期稳定期衰亡期单细胞微生物的典型生长曲线二、细菌分批培养群体生长规律根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律特点：分裂迟缓、代谢活跃。产生原因：（2）细胞分裂必需因子的缺乏（1）接种时的机械损伤引延迟期（滞留适应期）延迟期（滞留适应期）4、菌株的遗传性滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律研究滞留适期长短的意义？影响延迟期长短的因素：1、培养基成分2、接种物菌龄3对数期（指数生长期）特点：（1）代谢活性强（2）世代时短而稳定对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律对数期（指数生长期）对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律见教材P93Nt=2nN0n=3.33(lgNt-lgN0)G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)n——繁殖代数G——世代时(每繁殖一代所需的时间)N0——对数生长期开始微生物数量Nt——对数生长期经过时间t后微生物数量稳定期（最高生长量期）最高生长量期特点：1、细菌数量增加率为0。2、部分细菌大量积累代谢产物。细菌数量增加率为0的原因?二、细菌分批培养群体生长规律衰亡期特点：菌体活性降低、大量死亡；细胞畸变、自溶衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律什么时期菌体代谢产物最多什么时期细菌细胞代谢活性最强什么时候细菌细胞总数最多什么时期世代时间短而稳定对数生长期最高生长量最高生长量对数生长期对数生长期小结二、细菌分批培养群体生长规律二、连续培养（continuousculture）分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养恒浊法恒化法单批培养连续培养时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养连续培养原理二、连续培养以一定流速输入新鲜培养液并流出培养物，确保流出的老菌数等于新增殖数，使培养保持对数生长的过程。优点：一定生理状态实验材料提高工业生产效益保持细菌培养液浊度恒浊培养二、连续培养保持细菌培养液营养物质浓度恒化培养连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究恒化器Chemostat或bactogen概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不