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癌基因与抑癌基因杨金娥2015年3月26‾27日|正常细胞具有接触抑制、生长因子依赖、锚定依赖生长等特点。|接触抑制(contactinhibition):正常细胞在适当的体外培养条件下,虽能增殖分裂，但相互接触后，即停止分裂。|锚定依赖生长(anchorage-dependentgrowth)：正常贴壁生长的细胞必须依附在固体基质上才能生长，将它们悬浮在含培养液的固体培养基中不能增殖。|锚定非依赖生长(anchorage-independentgrowth)：细胞被转化后，能不依赖固体基质，在半固体(琼脂、甲基纤维素)培养基中增殖形成细胞集落---软琼脂(softagar)集落形成实验。是细胞恶性转化的重要征象。|致瘤性(tumorigenicity):转化细胞移植到敏感动物体内后能长出肿瘤的能力。常用裸鼠皮下接种。癌变过程相关的概念2|永生化(Immortalization):细胞从增殖衰老危机中逃离而具无限增殖能力的过程。特征：无致瘤性、接触抑制、生长因子依赖、锚定依赖生长|转化(Transformation):细胞获得致瘤能力的过程。特征：癌变过程相关的概念失去接触抑制致瘤性锚定非依赖生长3主要内容1.癌基因与抑癌基因的概念2.癌基因的发现与鉴定3.抑癌基因存在的证据4.原癌基因激活与抑癌基因失活的机制5.癌基因与抑癌基因的分类及功能4¾癌基因(oncogene):使细胞发生恶性转化的基因。¾原癌基因(proto-oncogene):是细胞的正常基因,调节细胞增殖与分化，表达受到严格控制。原癌基因具有激活成为癌基因的潜力。56z存在于病毒（大多数是逆转录病毒）基因组，可以使靶细胞发生恶性转化的基因；z不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用。病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)调节和调节和启动转录启动转录LTRgagpolenvsrcLTR长末端长末端重复序列重复序列癌基因正常的病毒基因正常的病毒基因产生病毒产生病毒核心蛋白核心蛋白产生逆转录产生逆转录酶和整合酶酶和整合酶产生病毒产生病毒外膜蛋白外膜蛋白产生产生酪氨酸激酶调节和调节和启动转录启动转录LTRgagpolenvsrcLTRLTRgagpolenvsrcLTR长末端长末端重复序列重复序列长末端长末端重复序列重复序列癌基因癌基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因产生病毒产生病毒核心蛋白核心蛋白产生病毒产生病毒核心蛋白核心蛋白产生逆转录产生逆转录酶和整合酶酶和整合酶产生逆转录产生逆转录酶和整合酶酶和整合酶产生病毒产生病毒外膜蛋白外膜蛋白产生病毒产生病毒外膜蛋白外膜蛋白产生产生酪氨酸激酶病毒基因组结构67病毒癌基因主要致癌机制：z直接引起细胞转化z持续感染→→慢性炎症→→细胞增殖→→突变积累→→癌变z感染引起免疫抑制，宿主免疫系统对发生转化细胞的识别能力降低。7抑癌基因（anti-oncogene）肿瘤抑制基因（tumorsuppressorgene,TSG）正常细胞中存在的一类调节细胞生长、增殖、分化的基因，具有抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的作用。8主要内容1.癌基因与抑癌基因的概念2.癌基因的发现与鉴定3.抑癌基因存在的证据4.原癌基因激活与抑癌基因失活的机制5.癌基因与抑癌基因的分类及功能9|1910年：Rous发现了致癌病毒—鸡肉瘤组织匀浆后的无细胞滤液皮下注射于正常鸡，可以引起肿瘤。这种微小的传染性介质被称为Roussarcomavirus(RSV)。癌基因的发现——病毒癌基因NobelPrizeinMedicine19661011|1963年：Dulbeco发现正常细胞感染RSV可恶变为癌细胞----病毒的体外转化癌基因的发现——病毒癌基因|保持转化需要RSV的持续存在tsRSV：温度敏感型的RSV突变株，37℃培养时能转化细胞，41℃时不能11|1969年：Huebner和Todaro提出病毒癌基因假说，确定转化的物质基础是病毒癌基因。Thetransmissionofviralandoncogenicinformationasgeneticelements(ratherthanasapathogenicresponsetoavirus)病毒携带的癌基因进入宿主基因组中，引起肿瘤。癌基因的发现——病毒癌基因12|1970年：Baltimore和Temin发现RNA病毒感染的关键物质逆转录酶；病毒感染宿主时，RNA经逆转录酶合成DNA并整合到宿主DNA，从而使病毒能够通过很多个细胞生长和分裂周期传递它的基因组癌基因的发现——病毒癌基因RSV为RNA病毒131974年：|Voger等发现缺少src基因的病毒不能引起细胞恶性转化。|Bishop和Varmusz得到第一个癌基因全序列，即来源于Rous肉瘤病毒的v-Src基因；z1975年，他们在正常动物细胞中发现了病毒癌基因v-Src的同源序列——细胞癌基因(cellularoncogene,c-onc),称之为c-src。癌基因的发现——病毒癌基因DNAtobetestedforpresenceofsrcsequences（含Src的wtRSV）（转化缺损的mt）Src特异的探针Src:sarc,shortforsarcoma14病毒癌基因的起源Theoncogeneinthevirusdidnotrepresentatrueviralgenebutinsteadwasanormalcellulargene,whichthevirushadacquiredduringreplicationinthehostcellandthereaftercarriedalong.ALV：禽白血病毒Pro-oncogenesarethecellularprogenitorsoftheretroviraloncogenes.152.1癌基因的发现——病毒癌基因1617病毒癌基因17HowSrcworks?•连接许多细胞内外多种重要信号途径的开关•病毒来源的Src缺少C端1819——第一个从人体肿瘤中分离到的癌基因|理论支持：1970s,病毒癌基因的发现及其细胞起源的证实（v-src与c-src）;|技术支持：1970s,DNA重组和细胞转染技术的建立，使得将基因导入哺乳动物细胞进行深入的功能研究成为可能。癌基因的发现——Ras19癌基因的鉴定|常用细胞：NIH3T3（具有连续分裂能力的永生化鼠成纤维细胞株，有接触抑制特性，无致瘤性；作为受体细胞）|NIH3T3转染癌基因：z细胞形态改变;失去接触抑制，致细胞重叠生长，形成集落---Colonyformationz锚定非依赖生长---软琼脂(softagar)z小鼠皮下成瘤。20211979年：Weinberg实验室通过转染提出小鼠基因组中含有可使NIH3T3发生转化的DNA片段。癌基因的发现——Ras3-MCDNANIH3T3C3H10T1/23-甲基胆蒽转化灶鼠成纤维细胞突变理论与化学致癌学说21221982年：三个实验室同时从人的膀胱癌细胞株中克隆了可使细胞发生转化的基因：H-Ras癌基因的发现——Ras221.2.3.231982年，确定转化基因与Harvey大鼠肉瘤(ratsarcoma,RAS)病毒癌基因同源----称之C-H-Ras1.2.3.从人肺癌细胞中分离到与Kirstern大鼠肉瘤病毒癌基因同源的转化基因---C-K-Ras；癌基因的发现——RasK-Ras突变发生在：50%结肠癌、70%-90%胰腺癌、30%肺癌中23241983年，从人神经胚胎瘤和肉瘤细胞中分离到第三个人类Ras基因---N-ras（与病毒无关）1.2.癌基因的发现——RasN-Ras突变发生在：20%-30%的白血病患者较少发生在在结肠癌等上皮细胞肿瘤中24|K-Ras,H-Ras,N-Ras分别定位于11、12、1号染色体RAS癌基因的结构其中，K-Ras有两种形式：K-ras4B,K-ras4A（thealternativelysplicedisoform）25Ras下游重要的信号通路丝状伪足片状伪足Fos，JunRASoncogenes:weavingatumorigenicweb2011,Naturereviewscancer26Ras：固定于细胞膜的内表面，与GTP和GDP有高亲和力;具潜在的GTPase活性；GEF：鸟嘌呤核苷酸交换因子GAP：GTPase活化蛋白信号传递因子：Rasplasmamembrane12,13,61mutation12,13,61mutationRAS第12、13和61位密码子是突变热点，点突变降低其固有的GTPase活性以及其与GAP的结合能力。Effector27主要内容1.癌基因与抑癌基因的概念2.癌基因的发现与鉴定3.抑癌基因存在的证据4.原癌基因激活与抑癌基因失活的机制5.癌基因与抑癌基因的分类及功能28抑癌基因存在的证据--细胞融合实验在正常染色体上存在有抑制细胞恶性表型或阻止肿瘤形成的基因。|化学试剂（聚乙二醇或病毒糖蛋白)使细胞膜发生融合|合体细胞：双细胞核大细胞29遗传性肿瘤的研究视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，RB)|儿童期（多在4岁以前）发病的一种眼内的恶性肿瘤|临床表现：早期为眼底灰白色肿块，以后肿瘤长入玻璃体，瞳孔呈黄色光反射，称为“猫眼”。|遗传型多为双侧发病，发病早，有家族史（40%的患者为遗传型）。非遗传型多为单侧发病，且在2岁以后才发病。30肾母细胞瘤（Wilms瘤，WT)婴幼儿肾脏恶性胚胎性肿瘤，患者腹部有肿块。3/4的肿瘤发生在4岁以前，90%在20岁前发生。可分为遗传型和非遗传型。遗传性（家族性）非遗传性（散发型）AD遗传散发双侧单侧早发晚发遗传性肿瘤的研究z肿瘤组织中WT基因纯合缺失，正常组织则为杂合子。zWilms瘤发生机理可能与视网膜母细胞瘤相同。31同是一种肿瘤,为什么既有遗传型又有散发型?发病年龄也不同呢?32视网膜母细胞瘤患者发生非视网膜肿瘤的频率二次打击假说（ProposedbyAlfredG.Knudson,1971）1601例RB患者33二次打击假说（ProposedbyAlfredG.Knudson,1971）|恶性肿瘤的发生需经两次以上的突变;|遗传性病例中，第一次突变发生于生殖细胞，使一个等位基因失去活性。在此基础上发生的第二次突变是体细胞突变，另一个等位基因也失活;|两次突变累加，即可完成启动（initiation)，而从良性细胞变成恶性细胞。因此，遗传型病例常为双侧或多发且发病较早。正常细胞更易于成瘤的细胞肿瘤细胞第一次打击第二次打击34|在非遗传性病例中，两次突变均为体细胞突变；|须在同一个体细胞中两次独立发生才能完成启动的过程；|机会较少，需经漫长过程的积累。非遗传性肿瘤多为单发，且发病较晚。二次打击假说35为什么正常细胞转化为恶性细胞需要两次以上的突变事件的发生？|正常人～1014个细胞，人的一生中进行～1016次细胞分裂，自发突变频率为～1.4×10-10，环境致突变剂的影响使突变频率要远高于该数值|如单个突变可致癌，仅据自发突变率计算，人一生中大约有28％细胞将癌变，那么癌症将是日常事件。二次打击假说二次打击假说解释RB的发病机制|RB属常染色体隐性遗传RB1（13q14）的两个等位基因都发生突变，才会发病37RB1长200kb，共含27个exons，mRNA长4.7kb，编码蛋白含928个氨基酸,具有多个磷酸化位点E2F结合区RB138cyclinE/A,cdc2,c-MycRb对细胞周期的调控作用GrowthfactorsG1期S期RpointRb--细胞周期的刹车寻找抑癌基因的步骤寻找潜在的含有抑癌基因的染色体区域|染色体鉴定术|杂合性缺失(LossofHeterozygosity,LOH)分析|连锁分析40染色体鉴定术NormalcellTumorcell白血病细胞株CCRF-CEM8号染色体部分区段出现了丢失。Rodericketal.,NatureProtocol,2007|