HCV抗体检测方法与检测策略

HCV抗体检测方法与检测策略亳州市疾病预防控制中心单三毛概述•结合《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（试行）》相关内容介绍丙型肝炎病毒抗体检测方法与检测策略•丙型肝炎病毒抗体检测的实验室内质量控制《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（试行）》抗体检测相关部分解读《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范》5《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范》《规范》共分9章，首次依据不同检测目的制定了不同的检测策略：1．疫情监测相关的检测策略2．临床诊断相关的检测策略3．血液筛查相关的检测策略6《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范》•《规范》首次在临床诊断中规定了HCV抗体筛查阳性反应后必须进行补充实验（免疫印迹或NAT）。•《规范》首次在丙肝临床诊断中引入S/CO比值的使用。•《规范》首次在血液筛查策略中规定了核酸检测（含poolingPCR）。•《规范》首次明确丙肝检测实验室质量控制。免疫诊断的特异性：NS3coreNS4NS5HCV免疫诊断抗原的策略•NS3+core•NS3+core+NS4•NS3+core+NS4+NS5HCV抗体检测方法•筛查试验•补充试验：蛋白印迹试验酶联免疫吸附试验化学发光试验胶体金法快速试验化学发光免疫分析（CLIA）化学发光酶免疫分析（CLEIA）:HRP标记、ELEIA、ALP标记免疫渗滤试验免疫层析试验检测模式的改进间接法夹心法竞争法灵敏度较低重现性不佳不适合定量灵敏度提高重现性提高可用于定量灵敏度/特异性更佳特异性更高适合定量雅培Axysm罗氏Elecsys雅培Architect10增加了核心区（C22-3）和NS3（C33C）区抗原，检测的敏感性和特异性较第一代RIBA有所提高。所用抗原由核心区的C22、NS3区的C33C、NS4区的5-1-1和C100及NS5抗原组成，较之第二代试剂增加了NS5。1990年Chiron/Ortho公司联合研制了第一代RIBA试剂，两种HCV抗原即C100-3和5-1-1分别固定在硝酸纤维素膜上。第一代第二代第三代HCV确证试剂的发展ChironRIBAHCV3.0SIAChironRIBAHCV3.0SIA•高低两个水平的人lgG内部质控，必须清晰可见，且21。•阳性对照条膜上虽有HCV带必须是2+或更强，hSOD条带必须明显的比人lgG内部质控水平1浅（-or+/-）。•阴性对照条膜必须能够见到每个HCV和hSOD条带，且比人lgG内部质控水平浅。14HCVBlot3.0（MP）3+质控带(血清加样）核抗原带NS3-1NS3-2NS4NS51+质控带(试剂加样)GST质控带HCV蛋白确证试剂包含HCV蛋白血清质控带血清转换期样本注：1，2，3为阳性样本4为阴性样本15HCVBLOT3.0(MP)结果分析膜条呈现结果分析所有条带出现1+反应度阴性2条或更多HCV条带呈1+反应度，或核抗原带呈2+反应度阳性仅一条HCV条带呈1+以上反应度，或抗原条带呈1+以上，但2+以下反应度不确定*仅有GST带反应可判为阴性GST质控带反应度为1+或以上，加上1条或更多HCV条带呈1+反应度可读成不确定。3+质控带(血清加样)核抗原带NS3-1NS3-2NS4NS51+质控带(试剂加样)万泰HCV抗体确证试剂本试剂应用重组免疫印迹法原理，在硝酸纤维素膜条上预包被HCV合成抗原、重组抗原（Core，NS3，NS4，NS5）及对照线蛋白。将硝酸纤维素膜条浸泡在稀释的血清或血浆样品中反应后，加入酶标记的抗人IgG抗体温育，如样品中含有HCV特异性抗体，则会形成“包被抗原-抗体-酶标二抗”复合物，加入底物液显色终止后，根据出现的不同条带情况判断结果。Chiron万泰显示条带分析结果未出现HCV抗体特异条带强度1+及以上HCV抗体阴性（N）至少出现两种HCV抗体特异条带（Core，NS3，NS4和NS5）强度1+及以上HCV抗体阳性（P）仅出现一种HCV抗体特异条带（Core，NS3，NS4和NS5）强度1+及以上HCV抗体不确定（IND）条带强度分值空白-小于对照线-1的强度+/-等于对照线-1的强度1+大于对照线-1的强度2+每条实验结果中，对照线-2必须出现，如果对照线-2不出现，则此条的检测结果无效。万泰HCV抗体确证试剂丙型肝炎病毒丙肝抗体假阴性问题HCV窗口期—TRANSFUSIONVolume40,February2000丙型肝炎病毒抗体检测策略HCV感染疫情报告的检测流程HCV血液筛查的检测流程HCV核酸定性检测用于血液筛查策略及结果报告HCV临床诊断筛查的检测流程HCV临床诊断补充试验检测流程（1）HCV临床诊断补充试验检测流程（2）HCV核酸定性检测用于临床诊断策略及结果报告3检测结果的解释检测结果的解释HCV检测试剂使用要求•必须使用经国家食品药品监督管理局注册批准的快速试剂{详细信息可登录国家药品食品管理局网站（）查询}。•试剂必须在有效期内使用。•推荐使用临床评估质量好的试剂{中国疾病预防控制中心网站（）}。2011年HCV抗体诊断试剂质量评估结果方法生产厂商酶联免疫法(ELIsA)27（国外3家）家化学发光方法美国强生公司、德国罗氏诊断公司、美国雅培公司；国内已注册的生产厂家有苏州新波公司、科美东雅公司等4家。蛋白芯片技术深圳益生堂胶体金技术国产的7家；进口注册只有韩国一家。重组免疫印迹法（RIBA）凯荣、MP、厦大与万泰合作的。HCV免疫学检测试剂检测目的检测方法检测策略及结果报告检测的意义HCV抗原检测HCV抗原检测检测目的a.HCV感染的早期诊断：窗口期，HCV（+）母亲所生的婴儿；b.免疫受损或缺陷；c.抗-HCV阳性患者的病毒血症分析；d.以流行病监测为目的的检测是为了解不同人群HCV感染率及其变化趋势。HCV抗原检测的方法发展：一HCV抗原检测原理示意图检测策略及结果报告HCV抗原检测结果解释a.HCV抗原检测阴性：HCV(-)b.HCV抗原初次检测（+），需双孔复检：若均为（-）则报告为HCV（-）；若双孔有一孔为（+），则报告为HCV（+）HCV抗原检测的意义丙型肝炎病毒抗原检测丙型肝炎病毒抗原检测结果解释HCV抗原检测试剂试剂名称生产厂商丙型肝炎病毒抗原测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）雅培MurexAg/Abcombinationassay(Abbott）雅培*MonolisaHCVBio-Rad（伯乐）丙型肝炎病毒核心抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）山东莱博生物丙型肝炎病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）中国医学科学院医学生物学研究所质量保证体系循环•实验数据及实验室的管理•安全性•客服患者/客户准备采集样本样品的接收与登记样本的递送质量控制检验结果的保存报告结果对工作人员检测能力的资格评估检测质控用材料的选择-校准品•用于对设备、试剂盒以及检测系统做出校准，以便于测定过程的标准化•尽管这些物质不是真正的标准品，但有时也称其为标准品质控用材料的选择-质控品•已知浓度的被分析物–两或三个浓度–检测时加入到病例样本中•用于验证检测体系的可靠性质控用材料重要特征•其值应覆盖临床高、中、低值•与检测样本（基质）相似•可大量获取•小量分装贮存•最好能至少持续使用1年•通常为生物材料，应充分考虑到其生物危害性对质控用材料的管理•需储备足量的同一批号的质控用材料或至少够一年使用•可冻存、冻干或采用化学方法进行保存•应保证其复原的准确性•应按照生产商推荐的方法进行贮存质控样本的来源•适宜的诊断用样本（患者样本）•来自下述途径：–另一个实验室–PT/EQA提供者•市售产品质控用材料的类型•定值–相关数值由生产商提供–实验室必须对其进行验证•非定值–相对较便宜–需进行数据分析•“自制产品”或“内部产品”–实验室自行采集的血清库–予以标明–小量分装保存，便于每日使用Levey-Jennings表-对质控值进行记录和评价80859095100105110115123456789101112131415161718192021222324平均值天+1SD+2SD+3SD-1SD-2SD-3SDWestgard规则•“多规则质量控制方法”•联合使用判定标准或质控规则•可对某种检测分析“是否”符合质控标准做出判断Westgard规则(通常情况下适用于在一次检测中同时采用两个浓度的质控材料的情况)•12S规则•13S规则•22S规则•R4S规则•41S规则•10X规则Westgard–12S规则•“警告规则”•两个浓度的质控材料中有一个浓度的结果在±2SD以外•对可能存在的问题提出警报•不能构成拒绝检测的原因•必须再以13S规则对其进行评价12SRule=一种能够引发对质控数据进行仔细核查的警报规则123456789101112131415161718192021222324平均值天+1SD+2SD+3SD-1SD-2SD-3SD不符合12S规则Westgard–13S规则•如果两个质控数据中有任意一个落在±3SD范围以外，则表示该次检测不符合Westgard规则•应拒绝该次检测•如果该检测没有破坏13S规则，则应对其进行22S规则评价13S规则=如果任意一项质控数据超出+3SD或-3SD的控制范围，则应拒绝该次检测123456789101112131415161718192021222324平均值天+1SD+2SD+3SD-1SD-2SD-3SD不符合13S规则Westgard–22S规则•如果同浓度检测材料的两相邻值在同方向上超出±2SD范围，或•同次检测的两个质控数值均超过±2SD•不得对该患者的检测结果出具报告•应采取修正措施22S规则=如果连续的两次质控测量值在同方向上均超过+2SD或-2SD的限度范围，则应拒绝该次检测123456789101112131415161718192021222324平均值天+1SD+2SD+3SD-1SD-2SD-3SD不符合22S规则Westgard–R4S规则•一个质控数据超过平均值的–2SD，另一个质控数据超过平均值的+2SD•这两次结果的偏差范围将超过4SD•产生随机误差，必须拒绝该次检测R4S规则=当一质控测量值超过+2SD而另一质控值超过-2SD的限度范围时，应拒绝该次检测123456789101112131415161718192021222324平均值天+1SD+2SD+3SD-1SD-2SD-3SD不符合R4S规则Westgard–41S规则•需要提供以前检测的质控数据•当某一浓度下有四次连续的质控数据超过±1SD范围，或•两个浓度下的质控数据均出现连续的检测结果超出±1SD范围的现象Westgard–10X规则•需要提供以往检测的质控资料•某一浓度下有十次连续的质控检测结果在平均值的同一侧，或•两个浓度下的质控数据均有五次连续的检测结果在平均值的同一侧10x规则=当10次连续的质控检测结果在平均值的同一侧时应拒绝该次检测123456789101112131415161718192021222324平均值天+1SD+2SD+3SD-1SD-2SD-3SD不符合10x规则质控规则•如果质控数据不符合质控规则，则应对其后的检测结果进行评价质控数据符合12s规则符合13s规则符合22s规则继续进行检测并结受检测结果否不符合质控标准——进行调查否否是是是当评价结果不符合某项规则时•警报规则=对质控数据点进行其他规则的审查•拒绝规则=“不符合质控标准”–停止检测–明确并修正问题–对患者样本及质控材料重新进行检测–在问题得到解决，并且质控结果显示状况良好之前不得报告任何病例的检测结果谢谢！