PCR技术原理

第五章PCR技术原理定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:PCR概念的提出1983，KaryMullis引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…thermusaquaticusTaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)1、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。一、PCR技术的基本原理和工作方式①94℃变性②50-65℃退火③72℃延伸2.PCR反应过程：20-40个PCR循环1个PCR循环PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+：DNA聚合酶的激活剂3.PCR基本要素4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸25-35个循环1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。4）PCR反应液的配制最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。总体积50-100l①缓冲液②dNTP（底物）③引物④模板⑤DNA聚合酶5、反应体系①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。③引物：1μM/L引物设计的一般原则①长度：至少16bp，通常为18-30bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于14-70个核苷酸的引物可用以下公式计算。Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N）N表示引物的核苷酸数目，[K+]表示单价离子即钾离子的浓度③避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3’端）。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3‘末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。④模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度75℃。PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。6.PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学1.长片段DNA的PCR扩增常规PCR长度为2kb以下。长片段PCR扩增存在的问题：（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物（3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解（4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难（5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度二、PCR的类型改进：(1)改进缓冲体系(2)采用混合DNA聚合酶主体使用扩增效率高，延伸能力强的TaqDNA聚合酶；少量使用具有3ˊ5ˊ外切酶活性的高温DNA聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。2.PCR扩增未知DNA片段1).染色体步查（移）（chromosomewalking）：是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程。2).反向PCR(inversePCR)一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。扩增原理：已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶步骤：首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，最后根据已知片段两端的序列设计引物，PCR扩增邻近的DNA片段。3).利用接头的PCR步骤：(1)基因组DNA的限制性内切酶酶切，（2）接头与限制性内切酶片段的连接，（3）已知序列侧翼未知序列的PCR扩增（利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物）。4).（1）热不对称交错PCRTAIL-PCR的基本原理：利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp）相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。sp1，sp2，sp3随机引物高浓度引物低浓度引物（2）不对称PCR3.与反转录相关的PCR扩增RT-PCR（reversetranscriptase-PCR,RT-PCR):又称反转录PCR,是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，可对基因的表达和序列多态性分析。ＲＴ－ＰＣＲＤＮＡ聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶反转录TTTnTcDNA第一链mRNA1）cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5’RACE：GSP3设计引物，合成cDNA第一链AAAAA…..AAAAnPoly(A)尾TTTTT…..TTTT5’APAAAAA…..AAAAnTTTTT…..TTTT5’用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链TTTTT…..TTTT5’--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTTTT…..TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3’RACE特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增2)差异显示PCR:(Differentialdisplayreversetranscriptase-PCR,DDRT-PCR)使用3’端的锚定引物（T12MN），通过反转录过程，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12亚份群体，这一过程叫差异显示反转录(DDRT).锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，M：A、C、G；N：A、C、G、T共有12种oligo(dT)12MN引物。4.PCR产生DNA指纹1）多重PCR(multiplexPCR)：设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR.使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性DNA(randomampificationpolymorphicDNA,RAPD)2）随机扩增多态性（randomampificationpolymorphicDNA,RAPD）是针对基因组DNA的限制性酶切片断进行选择性PCR扩增而建立DNA指纹的技术。1）基因组DNA的限制性内切酶酶切，2）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切DNA片段的连接，3）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接产物作PCR扩增。3）扩增片断长度多态性（AFLP,amplifiedfragmentlengthpolymorphism）GAATTCCAATTGTTAAAATTGAATTCTAATGCAATTTAATGAATTCMNVMNVAATT核心酶切延伸序列位点序列7.实时定量PCR(real-timePCR)常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反