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第五节目的基因与载体连接基因工程之二、目的基因与载体的连接（接）质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。几种重要的工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异碱基序列，切割DNADNA连接酶催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成cDNA碱性磷酸酶切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶催化3'-端合成同聚尾DNA连接酶E.coliDNA连接酶只能催化互补粘性末端之间的连接DNA连接酶（DNAligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘-OH末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。T4DNA连接酶催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点（一）粘性末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶核酸酶S1目的基因重组质粒本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！（二）平头末端连接（三）人工接头法合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。用接头连接用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++DNA连接酶接头(linker)本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！（四）同源多聚尾连接法尾接法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶+dGTP末端转移酶+dCTP本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点基因与载体的平末端连接方法有哪些？(1)T4DNA连接酶法连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4DNA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。（2）同聚物加尾法5’特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸。运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，在载体3’－OH末端延伸形成单链PolyT尾巴。将两者混合发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。3）用化学合成的衔接物连接DNA分子用化学合成法合成一段10－12个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5’端和目的基因片段5’连接起来。用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端。4）T-A克隆法：TagDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时，还能不依赖模版在产物3’末端加上两个游离的A。只要载体切口除人工加上的游离T，PCR产物即可于载体连接。T-A克隆•T-vector两条链的5’端含有一个游离的T•PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同随堂闯关随堂闯关质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后,两者的两端均具有相同的粘性末端,称为单酶切点的粘性末端,又称全同源性粘性末端⑴高背景载体经单一限制性核酸内切酶切割后,载体分子易于自我环化,既不利于目的基因的重组连接,大大降低阳性克隆效率,又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中,具有5’-P的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接,尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环,但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。⑵双向插入经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体,因二者的粘性末端是相同的,因此在连接反应中,目的基因可发生双向插入,载体对目的基因表达是有方向的,而目的基因可双向与之相连,这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响,若以表达为目的,我们就要对插入的片段进行方向鉴定,因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的,一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组,以便定向克隆。(YL)第六节重组DNA导入受体细胞基因工程之在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。转—重组DNA导入宿主细胞受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞(最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。具有接受外源DNA的能力；为限制性内切酶缺陷型菌珠或为DNA重组型菌珠；在标记上和载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培养条件下生存，有利于安全。受体细胞条件原核生物细胞是较为理想的受体细胞：①没有细胞壁，便于外源DNA的进入；②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，便于外源DNA与染色体DNA重组；③基因组小，遗传背景简单，便于外源基因的遗传分析；④容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，易重复。表达真核生物基因存在一定的缺陷，很多真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物活性的功能蛋白。需要进行适当的修饰酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下优点：①基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工程操作；②培养简单，适于大规模生产，成本低廉；③可以分泌表达，便于产物的提取和加工；④不产生毒素，是安全的受体细胞。真核生物细胞-酵母受体细胞植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。动物细胞同样可以作为受体细胞。早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为受体细胞，近年来干细胞成为新的研究热点。原核生物细胞，大肠杆菌优点：结构简单，便于操作分析缺点：表达蛋白可能没有活性真核生物细胞，酵母优点：表达蛋白加工具有活性缺点：操作相对麻烦大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。感受态是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。1、直接导入法：（1）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。（2）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。基因导入方法又称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。此法常用于转基因动物的基因转移。（1）微注射技术：是将外源基因直接注射到真核细胞内的方法；将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。（2）电转化法也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。该法可用于真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)的外源DNA的直接导入。电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。1.磷酸钙沉淀法利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与λ噬菌体DNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外包装法。（3）直接吸收法：Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。•该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要•Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。•但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。（4）基因枪技术又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰击法基本原理：将DNA吸附在微型子弹(1µm)的表面通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。基本做法：先将外源DNA溶液与钨、金等金属微粒(直径0.5-5µm)共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。基因枪转化的操作步骤靶细胞或组织的预处理微粒子弹的制备装备基因枪轰击过渡培养进行筛选培养或直接分化再生植株PDS-1000|HeSystem无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物