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Sf-900Sf-900Sf-900Sf-900IIIIIIIISFMSFMSFMSFM中文说明书优化的无血清培养基生长的昆虫和其他无脊椎动物细胞系表达重组蛋白Cat.No.:10902500mL1000mL10L组成缺少培养基Cat.No.:21012500mL不含L-甲硫氨酸和L-胱氨酸可根据要求定制包装储存条件：2 8°C，在黑暗中签收后的最低保质期：2个月注：目录编号21012请同时参阅组成缺少媒介补充。特点：草地夜蛾(Sf9,Sf21)、舞毒蛾(Ld)和粉纹夜蛾(Tn-368)高级生长细胞与市售的无血清和无血清培养基通过昆虫细胞培养系统生产重组蛋白质进行了优化(现有系统的2-10倍的增长)无蛋白质可扩展的各种生物反应器能够支持长期细胞生长的（大于20代）细胞适应其他市售的无血清培养基，可以直接在SF-900IISFM传代，通常不需要进一步的适应支持高产量的野生型AcNPV(occludedandnon-occludedvirus)说明Sf-900IISFM是支持多种昆虫细胞系细胞生长的增加，以及显着增加使用杆状病毒表达系统中生产重组蛋白的无蛋白培养基。欲了解更多关于昆虫细胞表达、增长重组蛋白的信息，见参考文献3-8草地夜蛾细胞（sf9）在sf-900IISFM中生长至9~12*106个细胞/ml时，rβ-半乳糖苷酶的表达达到最大细胞密度高达50U/ml，显着改善了竞争对手的配方和原来的SF-900的配方（见参考文献1和图1）舞毒蛾和粉纹夜蛾细胞系也观察到最大细胞密度增加20％到100％。BEVS最初由德克萨斯州A&M大学的Smiths等人研发的。传统上，Summers等人十三月添加10%胎牛血清的Grace’sTNM-FH昆虫细胞培养基用于BEVS技术。到目前为止，超过200个重组（基因）蛋白使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒转染sf9细胞系成功表达。Sf-900IISFM是为培养sf9和其他鳞翅目昆虫细胞系，生产昆虫病毒和rDNA蛋白而设计的，经改良不含血清的培养基。一些机构正在利用原来的SF-900的配方，在无血清环境下制作rDNA的蛋白。虽然优秀的Sf9细胞的生长和rDNA的蛋白表达，得到为大多数BEVS应用，但是由于选择性营养枯竭，以确定它的表达率会限制在高细胞密度（4.0*106细胞/ml）。Invitrogen公司的科学家都集中在更进一步优化病毒生产和rDNA的蛋白表达，于是有了SF-900IISFM的发展。SF-900IISFM配方相对于原来的SF-900SFM，在氨基酸、维生素、碳水化合物和之类成分中都有重大的变化。Sf9、Tn-368和Ld细胞在SF-900II中进行长期生长（20代），同时补充血清和无血清的对照组（SF-900SFM），可完全感染野生型和rAcNPV（表达β-半乳糖苷酶的克隆VL-941或EPO）。结果表明，细胞生长有着显著的改善（图2），病毒生产和rDNA的蛋白表达（图1）均超过其它的SFM或无血清培养基。无论是重组型还是野生型AcNPV感染进行培养，在呈指数增长时，就已达到密度为1.5~2.5*106个细胞/ml。这证实了SF-900IISFM在较大规模的培养系统中的效用相当于一个5L的CelligenTM生物反应器，用rAcNPV转染成功生产出rβ-Gal（图3）和rEPO（图4）。此培养基含有一种生物活性原料，是一个关键的生长促进成分。由于处理原料碳水化合物的变异，造成相关培养基的颜色可能会有所不同，但着色的差异对培养基的性能没有任何影响。当使用新批次的SF-900IISFM观察细胞生长，可能最初会高于或低于当时常规的SF-900IISFM。这通常是观察到的第一个细胞通过自己解决一个或两个细胞通道，才能适应新的大量介质。细胞培养过程一般资料草地贪夜蛾（sf9）培养细胞（ATCC#CRL，1711）在SF-900IISFM中细胞倍增时间约为20~24h。单层细胞将达到汇合在5~6天之时，变化中间在第3天。这些细胞在培养物中可很容易悬浮培养，经过摇床培养最高密度可达1*107个细胞/ml，培养孵育在28℃±0.5℃中。SF-900IISF-900IISF-900IISF-900IISFMSFMSFMSFM是一个完整的，准备使用的培养基。不要添加L-L-L-L-谷氨酰胺或表面活性剂如PLURONICPLURONICPLURONICPLURONIC®®®®F-68F-68F-68F-68。IIII无血清培养技术细胞适应约定——说明细胞适应SF-900IISFM时要考虑的方法有两种：1）细胞直接接种于含有血清的SF-900IISFM中；2）连续适应或“断奶”，至关重要的是细胞的存活率至少为90%且增长速度是在对数生长期中期开始适应程序之前。材料和设备孵化器能够保持28°C±0.5°C，大到足以容纳轨道摇床双平台。昆虫细胞培养中生长培养基：SF-900IISFM和目前使用的完全培养基显微镜，血球电子细胞计数仪低速离心机移液器：1ml、5ml、10ml、25ml巴斯德移液管250ml一次性无菌锥形瓶A.A.A.A.直接适应1）细胞生长在含有5%~10%胎牛血清的培养基中直接换成用预热的SF-900IISFM，在III的步骤1~10之后。2）当细胞密度达到1~3*106个细胞/ml时（种植4~6天），传代培养至密度为3*105个/ml.3）当细胞完全适应无血清培养后，约在培养7天后，它们将达到密度为4*106个活细胞/ml。4）免SFM的培养基适用于当活细胞数达到1~3*106个活细胞/ml且有90%存活率的，每周应传代两次的细胞。注意：如果使用直接适应法不能实现最佳性能，请使用顺序适应（“断奶”）法。B.顺序适应/断奶法1）传代培养的昆虫细胞生长在传统含有5%~10%血清的培养基与SF-900IISFM以50:50比例的培养基中。2）依据III的1~10步进行孵育，直到活细胞数超过6*105个/ml。混合等量的培养基和新鲜的SF-900IISFM传代培养。3）继续以这种方式细分培养基，直到计算出补充的血清含量低于0.1%，细胞的存活率大于85%，以及活细胞数超过6*105个/ml。4）传代培养至活细胞数达到1~2*106个/ml（约每次接种后4~6天）。5）在几个通路，在接种培养基7天之后，活细胞数达到4*106个/ml，细胞存活率达到85%，在这一阶段认为培养是适于SF-900IISFM的。IIIIIIII....单层培养材料和设备来自上文第I部分T瓶（25和75cm2）1）用10ml的吸管，吸取来自融合单层中间且悬浮的细胞，并丢弃；2）添加4ml新鲜的完全培养基于25cm2的烧瓶（12ml至75cm2的烧瓶）；3）用巴斯德吸管（或类似物品），通过吹打跨单层培养基重悬细胞；4）通过倒置显微镜观察单层细胞，确保完整的细胞从烧瓶表面脱离；5）收获活细胞并进行细胞计数（例如，使用台盼蓝排除法进行活细胞计数）；6）细胞接种在1.2×106cells/25cm2烧瓶或3.6×106cells/75cm2烧瓶中。7）将培养基放回温箱（28℃±0.5℃）8）在种植后的第3天，从单层细胞侧面吸出使用过的培养基，然后从另一边向烧瓶中添加新鲜的培养基。IIIIIIIIIIII....旋转培养材料和设备来自上文第I部分100ml或200ml转瓶旋转平台1）使用量筒或容量瓶作为参考，重新校准商业转瓶，做好标记。用叶轮装置完成校准，并从容器中取出；2）确保叶轮机自由旋转，不要接触瓶壁或瓶底（sf9昆虫细胞对物理剪切十分敏感）；调整微调机制，使轮翼在烧瓶两侧和瓶底（调整前需高压灭菌）；3）4、6混合在75cm2的单层烧瓶中，需要使用100ml培养基（4~5个烧瓶用于旋转培养，1个用于备份）4）按描述II的1~4步骤吹打细胞；5）汇总细胞悬液并做细胞计数；6）在完全培养基中，稀释细胞悬液至约3*105个活细胞/ml；7）对于培养体积为75~100ml，使用100ml的微调容器。对于培养基体积为150~200ml，使用250ml的容器。8）联合培养应在250ml微调容器中加入150ml培养基，桨叶的顶部略高于培养基，它为培养基提供了额外的空气；9）完成大气气体平衡是通过松开侧壁盖（约1/4圈）。10）孵育微调器，在在28±0.5℃下以恒定的搅拌速度为每分钟75转。11）当细胞计数约3*105个/ml时，每周2次补充微量培养基以清洗微调培养基。12）每两个星期，将旋转培养器以100*g离心5min，轻轻离心，再悬浮细胞于新的培养基中，以减少累积的细胞碎片和有毒的代谢物。IVIVIVIV....培养摇床材料与设备来自上文第I部分能放入250ml锥形瓶的双平台轨道摇床一次性250ml锥形瓶协定A.A.A.A.振动筛装置1.轨道摇床设备必须能达到135转2.必须是250ml标准无菌锥形瓶（特别是当工作时应降低血清或无血清培养基）3.轨道摇床/瓶组件应保持在一个28℃±0.5℃，不加湿无气环境中4.通风是通过松开盖1/4圈完成（在里面中间关闭位置）。在此条件下，细胞没有氧气限制，因此，它们会以最大速率扩散B.B.B.B.培养操作1.在250ml培养烧瓶中加入100ml含有3*105个活细胞/ml的完全培养基2.添加胎牛血清的培养基培养应维持在摇床转速为80~90转，对于无血清培养基，摇床应保持在每分钟125~135转3.每周两次以约3*105细胞/ml进行传代培养4.每三个星期，将旋转培养器以100*g离心5min，轻轻离心，再悬浮细胞于新的培养基中，以减少累积的细胞碎片和有毒的代谢物。注意：Sf9不依赖于静置培养，需要旋转培养才能保持活力、形态，以及增长率稳定。然而，由于培养基可能依通道数量而定，冻存的细胞株应建立新鲜的培养基。VVVV....超低温保存材料与设备二甲基亚砜细胞冻存瓶新鲜的SF-900IISFM细胞培养级牛血清白蛋白A.A.A.A.冷冻1.准备所需冻存的细胞，在摇床上培养，收获中间在对数期生长且活细胞数90%的细胞2.确定活细胞数并计算所需体积的冷冻保存培养基，制成最终细胞密度为0.5~1*107个细胞/ml3.准备所需体积的冷冻培养基，即在新鲜的SF-900IISFM培养基中添加7.5%的二甲基亚砜和10%的胎牛血清制成冷冻培养基，保持培养基在4℃4.从培养液中沉淀细胞，以100*g离心6min。重新悬浮颗粒确定4℃冻存培养基的量5.细胞悬浮液在4℃下孵育30min（直到冰冷）6.根据制造商规格（即4.5ml至5.0ml离心管），等份分配悬挂冻存管7.依据标准程序，进行自动或手动控制冷冻速率设备实现冷冻保存8.要在下面使用稳定的冷冻液氮冻存细胞B.B.B.B.复苏1.一小瓶细胞在37℃水浴中快速解冻，恢复冷冻培养基。依照V中A步骤1~4，转移瓶内所有内容物至添加100ml完全培养基的250ml烧瓶中，并孵育培养基2.复苏后的两个培养基中要保持3*105~1*106个细胞/ml，随后使用正常的培养时间培养基补充组份缺陷当使用目录号21012时，补充需符合下列浓度与原配方21012为1g/L的L-蛋氨酸0.15g/L的L-胱胺酸二钠