牛副结核分支杆菌的研究进展

牛副结核分枝杆菌的研究进展李景玉1刘爱国1梁大勇1郝贵君2李志彬3赖俊英4（1白城市畜牧总站、2洮北区动物监督所、3洮北区东风乡畜牧站、4镇赉县镇赉镇畜牧兽医技术服务站）关键字：牛副结核分支杆菌分子病原学检测核酸疫苗副结核病(Paratuberculosis)是由副结核分枝杆菌即禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis,MAP)引起的一种以反刍动物为主要宿主的慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的传染病，也称Johne’s病[1,2]。牛感染MAP后，直到2~5岁才会出现临床症状，病牛表现慢性腹泻、体重迅速减轻、奶产量和繁殖力下降。除反刍动物外，猪、马、野生动物等也有发病的报道，所以该病现己成为危害非常严重的传染病之一，被OIE列为必报传染病，我国也将其列入三类传染病。1910年Trowt根据柯赫(Koch’s)法则成功地在实验室分离到该病原体，并实验性地感染牛复制出副结核病[3]。美国的Chiodini[4](1983年)等证明从克隆病(Crohn’sdisease,CD)患者体内分离到的菌株染色体中含有MAP的特异DNA序列IS900，这一发现不仅给医学界，而且给兽医界带来了很大震动，此后，很多资料表明MAP与人类的CD存在联系。所以，Johne’s病越来越受到世界各国的瞩目。笔者欲从副结核分枝杆菌的分子病原学，检测技术及疫苗的研究进展进行综述。1副结核分支杆菌禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis,MAP)为平直或微弯的杆菌，因有分枝生长的趋势而得名。最显著特性是胞壁含有大量类脂，可达菌体干重的40%左右，生长形成粗糙菌落，而且也难以用一般染料染色。但在抗酸染色后，含有3%HCI的酒精又不易使之脱色，这一类能抵抗盐酸酒精脱色的细菌称为抗酸菌。本属菌种类颇多，属内除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌外统称为非结核分枝杆菌[5]，其中部分是致病菌或条件致病菌。本属菌在自然界分布广泛，许多是人和多种动物的病原菌。对动物有致病性的主要是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、副结核分枝杆菌等。MAP为需氧、革兰氏染色阳性、无运动性的非结核分枝杆菌(0.2~0.5μmⅹo.5~1.5μm)。在人工培养基上生长缓慢，最适生长温度为37.5℃，需要1~2个月才能长出针尖大小的白色、坚硬、粗糙的菜花样小菌落，且依赖分支杆菌素，少数菌株可产生黄色素，在组织或粪便中成团或成丛存在。副结核病的潜伏期长，患畜长期大量排菌，传染性强，很难净化[6]。MAP主要由消化道感染，受感染的动物即使无明显的临床症状，也可能随粪便排出病原菌。在患畜体内，MAP主要位于肠道和肠系膜淋巴结处。感染通常是由于食入临床病例或亚临床带菌者的粪便或被污染的食物引起。有时病原菌可侵入血液，因而能随乳汁和尿排出体外。从肝、肾、脾和性腺中也可以分离出病原菌，35%临床病例及l既亚l喻床者的乳汁中携带有病原菌，尤其是初乳，病原菌含量更高。经子宫感染是副结核病传播的一种重要途径，有临床症状的乳牛子宫感染率为50%，亚临床症状的病例子宫感染率为9%。少数感染副结核病公牛的精液中也携带有MAP。该菌对自然环境抵抗力较强，在河水中可存活163天，在粪便和土壤中存活11个月，在牛乳和甘油盐水中可存活10个月。对热较敏感，63℃30min、70℃20min、80℃5min即可被杀死。抗强酸强碱，在5%草酸、5%硫酸、15%安替福民、4%苛性钠溶液中30min仍保持活力。而3%来苏儿30min、3%福尔马林20min、3%~5%石炭酸5min内可将其杀死[7]。该菌是胞内生长菌，细菌侵入机体后，在机体内首先产生细胞免疫，然后出现体液免疫。细胞免疫随着病情加重而降低，体液免疫随着病情发展而增强。2副结核分支杆菌分子病原学2.1研究者通过各种试验方法对副结核分枝杆菌进行了分型：2.1.1用聚合酶链式反应（PCR）方法分型，例如：在Juan等[9]研究中，应用PCR方法对分离自西班牙不同地区的164株驯养反当动物的MAP菌株(83株来自山羊、78株来自奶牛、3株来自绵羊)分析发现:31.7%(29株来自奶牛、20株来自山羊、3株来自绵羊)属于S型。2.1.2用限制性片段长度多态性(RFLP)方法分型BartoS[10]等应用RFLP方法分析了来自世界四大洲的分离自牛、羊、野生动物、无脊椎动物及小脊椎动物、外界环境及CD患者的1750个菌株，作者应用了两种限制性内切酶即:PstⅠ和BstEⅡ工，结果经过PstⅠ消化，巧种RFLP型被检测到(A一0)，经过BstEⅡ消化，发现了34种型(CI一C29、11一12和51一53)。2.1.3用多重PcR整合基因座(MPIL)方法分型：例如：2004年，Motiwala等[11]研究了从美国6个地区33种不同动物中分离到的109株分枝杆菌。应用MPIL方法分析了76株副结核分枝杆菌，其中67株形成一个单一的进化枝，Simpson’s多样性进化指数为0.53。相反，简单序列分析表明，33种来自动物的分离株可以归为8个亚群，说明了特殊菌株在种间传播中的作用，为MAP的种间传播提供了证据。2.1.4用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法分型:例如：2005年，Juan等[12]，应用PFGE等技术分析了44株做MAP山羊分离株的遗传多态性，PFGE技术将这些分离株划分为13个PFGE型，即[2一1]、[1一l]、[1一12]、[3一2]、[2一10]、[12一10]、[13一l0]、[14一1]、[15一1]、[16一11」、[17一l]、[18一1]、[19一13]，比较先前的研究结果，其中有10个型为到目前为止只在羊分离株中发现的，其中除了两株类似于中间群Ⅲ型以外，其余均为Ⅱ型。2.1.5用M!RU(分杆菌分散的重复单元)—VNTR(数目可变的重复序列)方法分型:例如：Biet等[13]，选用35个MIRU一VNTR基因座，应用VNTR技术，将MAP分为5个亚类，为该菌的研究提供更多的遗传多样性工具。:VNTR除具备以PCR为基础的分型方法的优点(即快速、简单、用菌量少)外，还可以利用不同的拷贝数产生简单的数字结果，在实验室内和实验室间具有很好的可比性，所以其应用较广泛。另外，Marsh等应用微阵列技术比较了1个羊分离株和2个牛分离株，鉴定了在羊分离株中有3个大的基因缺失，共29208bp包括24个ORFS。Dohmann等[14]联合应用表象差异分析和DNA序列比较的方法研究4个I型与9个H型菌株的区别，发现H型菌在基因组中有一个存在1lbp插入序列的特异区域。而I型菌含有3个型特异基因座，这在H型菌中不存在，但是在禽分枝杆菌中存在。2.2.副结核分枝杆菌相关蛋白研究进展2.2.1具有抗原活性蛋白分枝杆菌分泌蛋白已被确定是感染早期的主要抗原，shin等(2005年)纯化了5个MAP重组蛋白Ag85A、85B、85C、SOD和35ku蛋白，检测它们对粪便培养阳性的、培养阴性的奶牛外周血单核细胞(PMBCs)的刺激能力，结果重组蛋白Ag85A、85B、85C诱导阳性牛的PMBCs产生明显的淋巴细胞增生，并产生IFN一γ、IL一2、IL一12、TNF一α。，但没有IL一4，健康牛没有发现增生现象。35ku蛋白诱导患病牛的淋巴细胞增生和IFN一、IL一4产生。85A和85B刺激产生CD4＋T细胞和CD25＋(IL一2R)T细胞，35ku蛋白主要刺激CD21＋B细胞参与体液免疫应答。SOD比其它抗原的免疫刺激性弱,但能比较强地激活T细胞，所以推测其在感染早期(如病原进入时期)的重要性.Broere等[15](2007年)采用了鼠模型。用Hsp70和DDA佐剂(Hsp70/DDA)免疫BALB/c鼠，OVA/DDA作对照处理，免疫后4和7天流式细胞仪测BrdU掺入量，免疫后7天发现Hsp70免疫的鼠比较OVA对照鼠引流淋巴结的BrdU掺入量增高。另外，细胞外B细胞的再刺激表明仅Hsp70免疫后7天引流淋巴结表现为抗原特异的B细胞应答增强，而OVA处理的鼠B细胞没有产生明显的特异性的抗体。2.2.2与血清学检测有关的MAP蛋白Sugden(1987)就从MAP中制备了脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和脱脂阿拉伯甘露聚糖(AM)，用酚一水萃取的粗多糖进行高速离心、亲和及阴离子交换层析纯化LAM，发现1少M在补体结合反应中是有活性的，而AM没有。为MAP的检测奠定了基础。1988年，何昭阳[16]等，采用ELISA方法对MAP进行了检测，方法中采用热处理草分支杆菌抗原吸附处理，获得比较好的结果。LLi等2007年报道，MAP1272c蛋白能选择性地与Johne’s病的阳性牛血清发生反应，显示了其在MAP免疫诊断方面作为抗原的潜在应用价值。同年，Pradenas[17]等研究了MAPCF中含有的能与感染牛的血清发生反应的抗原蛋白，CF蛋白的抗原性用分离自4头不同的自然感染奶牛的血清用免疫印迹检测，20~40ku的蛋白与血清反应强烈。2008年，Bannantine等建立了检测宿主血清中MAP抗体的蛋白微阵列，能够直接比较MAP蛋白与它们的免疫能力之间的关系。2.2.3其它蛋白的研究Sung等在2003年用SOS一PAGE比较了7H9一OADC、WR一GD、7H9一GD培养基上生长的MAP，发现34.2ku和14.0ku蛋白表达增加与细菌具有高水平的耐酸性有关，而56.6ku和41.3ku蛋白与低水平的耐酸性有关。疫苗方面的研究中，2008年，Park等应用建立的结核分枝杆菌特异性信号转导系统，在预选MAP基因时产生定点突变以提高等位的转换效率。突变成功地发生于MAPK—10株和重组的带有表达绿色荧光蛋白基因(gfp)的K一10株中，提高了MAP断裂选择基因的效率，加速了疫苗检测和研究突变株的发展。2.3MAp的毒力岛Stratmann在2004年应用表象差异分析法(RoA)鉴别了一种做P特异ABC转运体(mpt)操纵子，包括六个ORFs，即mptA~F功能基因组学揭示mpt操纵子侧面是一个与摄取Fe3+有关的fep簇编码蛋白，另一端是编码非核蛋白体依赖的杂环的铁载体合酶sid簇;这些基因形成38kb的MAP特异基因座，侧面是与IS1110相似的插入序列。应用Westernblot分析表明MptC存在于MAP的被膜部分，MptD暴露于表面，这个38kb基因座组成了MAP的一个毒力岛。2.4MAP受体徐凤宇博士证实体外培养的上皮细胞有效地附着和摄入MAP需要FAP一P的表达，它介导MAP与FN的结合。Feoerda[18]于2007年等调查了有关MAP相关的病原识别受体(pathogenreeogniti。nreeeptor，PRR)，发现在体外用MAp刺激鼠巨噬细胞、人外周血单核细胞(PBMC)后，TLR2和TLR4敲除鼠的巨噬细胞相对对照组而言产生比较少的CK，TLR4被抑制的PBMC用活的撇P刺激后CK的产生也减少。另外发现TLR通过髓性分化因子88(Myd88)诱导产生TNF一α、IL一β和IL一10。人胚胎肾细胞的核昔酸结合寡聚蛋白2(NOD2)应答于MAP的刺激，3020insC移码突变纯合个体的PBMC在MAP刺激后显示70%CK应答缺陷，这项研究的结果表明，TLR2、TLR4和NOD2参与了天然免疫系统对MAP的识别。3副结核分枝杆菌的检测技术目前，诊断副结核病的方法有琼脂免疫扩散试验(AGID)、凝集反应、补体结合反应、免疫电泳、免疫荧光、放射免疫、胶体金等方法检测抗体、ELISA、和IFN一γ一ELISA等方法，以及基于特异性插入序列IS900、特异序列F57的DNA探针及PCR诊断方法和传统的细菌分离培养法等.由于动物在出现临床症状之前血清学反应不明显，使其应用受到局限，但对于处于临床阶段的病牛而言，血清学方法的敏感性和特异性均很高，也是检测临床阶段病牛常用的方法。目前，诊断该病最确