血涂片的制作和

实验三血涂片的制作和血细胞的观察、计数、血型鉴定《普通生物学》——实验目的•掌握血涂片的制作，了解各种血细胞的结构特点•掌握人体微量采血和用血细胞计数板进行细胞直接镜检计数的方法•掌握ABO血型的鉴定方法材料和用品•材料–人血或兔血•主要用品–生物显微镜,采血针,双凹载玻片,血细胞计数板–红细胞稀释液（氯化钠、硫酸钠、氯化高汞）–白细胞稀释液（冰醋酸、龙胆紫）–标准A、B血清–瑞氏（Wright）染液实验内容与方法（一）ABO血型鉴定1．实验原理•红细胞膜上具有血型糖蛋白，作为抗原，也称为凝集原；ABO血型就是根据红细胞表面抗原来确定的，根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。•血清中含有相应的特异性抗体称为凝集素。•凝集原和相应的凝集素特异性结合，使红细胞凝集成团，进而引起红细胞破裂，产生溶血。•ABO血型鉴定的原理是利用红细胞凝集试验，将待测血液分别与已知含A抗体和B抗体的标准血清混合，观察是否发生凝集现象，判断待测血液红细胞上有何种抗原，由此确定待测血液的血型。ABO血型分类ABO血型正反定型结果（一）ABO血型鉴定2．血型鉴定方法•标记凹载玻片：左上角写A，右上角写B。•分别吸取标准A血清和标准B血清各1滴滴于双凹载玻片左端和右端。•采血针刺破左手无名指尖，待血液出来后，用2支毛细滴管吸取血液，分别加入到玻片左、右两侧的血清内，并用牙签搅拌，使标准血清与血液混匀。（切勿混用毛细滴管和牙签！）•手持玻片转动数次，转动时玻片应保持在一个水平面上，然后置室温下5min后观察结果。•肉眼观察：如果外观略呈花边状或锯齿状，看上去有沉淀，则多为凝集；如果血滴呈均匀状态，边缘整齐，则多为不凝集。•进一步在低倍镜下观察：在低倍镜下，如果观察到红细胞凝集成团，或尚有少数游离细胞，则为凝集现象；如果红细胞均为游离状态，则为不凝集。根据镜下所见有无凝集现象判定血型。（二）血涂片的制作和血细胞的观察1．血涂片的制作•用酒精棉球擦拭消毒指尖，用采血针刺破指尖，从采血针眼处挤出绿豆大小血滴，用清洁玻片面的一端轻轻接触血滴，使血滴附于玻片面上（注意勿触及皮肤，否则血在玻片上就不能成滴）•以左手拿该片的两端，迅速用右手拿住另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片•涂片在空气中干燥后置于染色架上，滴加瑞氏染色液，使涂片被染色液覆盖•染1分钟后，再加等量的缓冲液于染色液上，浸染约5~8分钟此时涂片表面呈现一层古铜色•用蒸馏水迅速冲洗，见涂片呈粉红色后，自然晾干（二）血涂片的制作和血细胞的观察2．血细胞观察制作良好的血涂片厚薄适宜，血膜分布均匀，呈粉红色。选一厚薄适宜部位置显微镜下观察。先用低倍镜观察全片，了解涂片染色、细胞分布情况，再用油镜观察•(1)红细胞数量最多，体积小而圆、均匀分布，呈红色的圆盘状，边缘厚，着色较深，中央薄，着色较浅，无细胞核、细胞器，胞质内充满血红蛋白。•(2)白细胞白细胞数量较红细胞数量少，但胞体大，细胞核明显，极易与红细胞区别开。•嗜中性粒细胞是白细胞中较多的一种，约占白细胞总数50-70%。体积比红细胞大，主要的特征是胞质中的特殊颗粒细小，分布均匀，着淡紫红色。胞核着深紫红色，一般分3—5叶，叶间以染色质丝相连。核分叶的多少与该细胞年龄有关，如核为杆状，则为嗜中性粒细胞的幼稚型。•嗜酸性粒细胞比中性粒细胞略大，数量少，约占7%以下。核常分两叶，着紫蓝色。主要特点是胞质内充满粗大、圆形的颗粒，色鲜红或桔红。•嗜碱性粒细胞数量很少，约占1%以下。在一般血涂片上不易找到，体积比上述2种白细胞稍小。胞质中分散着许多大小不一的深紫蓝色颗粒。胞核形状不定,圆形或分叶，也染成紫色，但染色略浅，一般都被颗粒遮盖，形状不清。•淋巴细胞数量较多，约占20%-40%，可见中、小型，淋巴细胞。其中小淋巴细胞最多,略大于红细胞。核大而圆,几乎占据整个细胞，染成深蓝紫色。胞质极少，仅在核的一侧出现一线状天蓝色或淡蓝色的胞质。中淋巴细胞比红细胞大，胞质较小淋巴细胞的稍多，着色较浅。核圆形或卵圆形，位于细胞中部，也染成深蓝紫色。•单核细胞数量少，约占2%-8%，是细胞中体积最大的一种，胞核呈肾形、马蹄形，常在细胞一侧，着色比淋巴细胞浅。•血小板为形状不规则的细胞小体，其周围部分为浅蓝色，中央有细小的紫色颗粒，常聚集成群，分布于红细胞之间。高倍镜下一般只能看到成堆的紫色颗粒，在油镜下才能看到颗粒周围的浅色胞质部分。（三）血细胞计数1．血细胞计数板的构造•计数板是一块特制的长方形厚玻璃板，板面的中部有4条直槽，内侧两槽中间有一条横槽把中部隔成二长方形的平台。•平台比整个玻璃板的平面低0.1mm，当放上盖玻片后，平台与盖玻片之间距离（即高度）为0.1mm。•平台中心部分各以3mm长，3mm宽精确划分为9个大方格，称为计数室，每个大方格面积为1mm3，体积为0.1mm3。–四角的大方格，又各分为16个中方格，适用于白细胞计数。–中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm3，体积为0.004mm3。–每个中方格又各分成16个小方格，适用于红细胞计数。2．血细胞计数（1）兔血稀释•1.5ml塑料离心管：0.38ml白细胞稀释液放入小试管内+0.02ml兔血•5ml塑料离心管：3.98ml红细胞稀释液＋0.02ml兔血•血液应加入试管底部，滴入计数室前试管摇振1-2min。•将盖玻片放在计数板正中，用白色小号Tip头吸取摇匀的稀释血液，将一小滴血液滴在盖玻片边缘的玻片上，使稀释血液借毛细管现象而自动流入计数室内。–如滴入过多，溢出并流入两侧深槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸片把多余的溶液吸出，以深槽内没有溶液为宜。–如滴入溶液过少，经多次充液，易造成气泡，应洗净计数室，干燥后重做。–红细胞和白细胞的计数，各使用一计数室。•血液稀释液滴入计数室后，须静置2-3min，然后在低倍显微镜下计数。2．血细胞计数（2）计数•计数白细胞时，数四角4个大方格的白细胞总数•计数红细胞时，数中央大方格的四角的4个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）的红细胞总数–计数时应循一定的路径，对横跨刻度上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。–计数白细胞时，如发现各大格的白细胞数目相差8个以上；计数红细胞时，如各中方格的红细胞数目相差20个以上，表示血细胞分布不均匀，必须把稀释液摇匀后重新计数。2．血细胞计数（3）计算•细胞数＝计数板相应方格内细胞总数×稀释倍数×1/计数室总体积•白细胞数＝4个大方格内数得白细胞总数×20倍×1/1×1×0.1×4mm3，即乘以50，即得每mm3血内的白细胞总数•红细胞数＝中央大方格中的5个中方格内数得的红细胞总数×200倍×1/0.2×0.2×0.1×5mm3，即乘以10，000，即得每mm3血内红细胞总数•按目前临床上血细胞计数采用的通用单位，将以上所获每毫升血液中所含血细胞数量换算为各血细胞在每升血液中的数量2．血细胞计数（4）清洗血细胞计数板盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。计数板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净为止。作业与思考•1.将血细胞计数实验结果填入下表：•2．根据实验体会，分析影响血细胞计数准确性有哪些因素？•3．受试者的ABO血型属于哪一型？试述判断依据。