苦菊提取物的抗氧化活性研究---食品与药品-&医药专业

食品与药品FoodandDrug2011年第13卷第03期93苦菊提取物的抗氧化活性研究陈超杰1，秦海林2，邓安珺2，王爱平1*（1.新药安全评价研究中心，2.中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室中国医学科学院/北京协和医学院，北京100050）摘要：目的研究苦菊提取物的体外抗氧化作用。方法苦菊经95%乙醇加热回流、石油醚脱脂、乙酸乙酯提取和大孔吸附树脂乙醇洗脱，取60%乙醇的洗脱液挥干后得到提取物。通过二苯代苦味酰自由基（DPPH•）和超氧阴离子（O2-•）清除能力的检测，及2,2’-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢（AAPH）诱导的红细胞溶血模型的测试，总体评价该提取物的体外抗氧化活性。结果该提取物能有效清除DPPH•和O2-•，其清除能力呈浓度依赖性，且清除O2-•的能力比阳性对照药维生素C更佳。同时，该提取物能有效防止AAPH诱导的兔红细胞溶血，提示具有预防机体细胞组织氧化应激损伤的作用。结论苦菊提取物具有很好的抗氧化活性，为其在食品和药品的抗氧化剂应用提供参考。关键词：苦菊；二苯代苦味酰自由基；超氧阴离子；红细胞溶血；抗氧化活性中图分类号：R282.7文献标识码：A文章编号：1672-979X（2011）01-0093-04收稿日期：2010-12-10基金项目：“重大新药创制”科技重大专项课题（2008ZX09305-001）作者简介：陈超杰（1982-），男，广西梧州人，博士研究生，研究方向为药物安全性评价*通讯作者：王爱平，男，博士生导师，研究方向为药物安全性评价E-mail:[e-mail]-jie1,QINHai-lin2,DENGAn-jun2,WANGAi-ping1(1.NewDrugSafetyEvaluationCenter，2.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine,InstituteofMateriaMedicaChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)Abstract:ObjectiveTostudytheantioxidantactivityofextractfromCichoriumendiviaL..MethodsC.endiviaL.wasrefluxedwith95%ethanolanddefattedwithpetroleumether,andthenwasextractedbyethylacetateandpurified素、维生素等。XF-1经形态特征，16SrDNA序列比对及系统发育树分析，与Aranicolaproteolyticus有99.7%同源性，初步认为同种。Aranicolaproteolyticus为近年新发现的肠杆菌科新菌种，目前国际上正式命名尚未公布，因此关于该菌的文献报道甚少，1999年Park等[11]发现该菌，并初步研究了其生理特性。但该菌所产分泌物的种类以及是否有致病性尚不明确，这是决定应用价值的最关键问题，今后以此为研究方向进行深入研究。参考文献[1]周世水，丁金国，姚汝华.海洋微生物药物的开发和应用[J].工业微生物，2002，32（2）：48-51.[2]胡艳红，张庆林，王正平.海洋微生物生物活性代谢物研究进展及技术问题[J].科学技术与工程，2004，4（2）：160-163.[3]MarxJC,BlaiseV,CollinsT,etal.Aperspectiveoncoldenzymes:currentknowledgeandfrequentlyaskedquestions[J].CellMolBiol,2004,50(5):643-655.[4]张士瑞，马军英，范晓.海洋生物技术原理[M].北京：海洋出版社，1997：10-13.[5]杨丽，闫志勇，王斌，等.嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组文库的构建及部分克隆的分析[J].医学研究生学报，2010，23（4）：369-371.[6]GarrityGM,BellJ,LiibumG.Bergey'smanualofsystematicbacteriology(secondedition)[M].NewYork:BerlinHeidelberg,2004:80-83.[7]闫志勇，王斌，苏维奇，等.多重半套式PCR检测细菌16SrRNA基因方法的建立[J].青岛大学医学院学报，2001，37（1）：22-24.[8]张桂红，付勇，刘彦仿.来源于中国青蛙的一种核糖核酸酶新基因的克隆和序列分析[J].医学研究生学报，2010，23（1）：110-112[9]宋欣.微生物酶转化技术[M].北京：化学工业出版社，2004：16-18.[10]熊振平.酶工程[M].北京：化学工业出版社，1989：40-41.[11]ParkH,SonK,ParkD,etal.Protease,agenethereforandtheusethereof:USP.US7563872B2[P].2009-07-21.94食品与药品FoodandDrug2011年第13卷第03期自由基是导致油脂类产品氧化变质和造成机体氧化应激损伤的主要因素，因此具有清除自由基能力的抗氧化剂是防止食品变质和防治氧化损伤相关疾病的最主要手段之一[1]。苦菊（CichoriumendiviaL.）是菊科菊苣属的一种栽培植物，学名栽培菊苣，又称苦苣[2]。苦菊源自欧洲，是欧美地区常用的色拉或食用蔬菜。有研究发现，苦菊中含有一定量的抗氧化活性成分，是其防治多种与氧化应激损伤相关的慢性疾病的理论基础[3]。我国已成功引种栽培苦菊并出售，其清甜爽口的特点也逐渐受到中国老百姓青睐。但至今仍缺乏对国内栽培的苦菊生物活性的研究报道。本文提取分离苦菊，并通过体外模型检测其抗氧化活性，为进一步探究苦菊在食品和医药领域的应用提供依据。1材料1.1原料苦菊购自北京新发地蔬菜批发中心，经鉴定为菊科菊苣属植物苦菊。1.2试剂二苯代苦味酰自由基（DPPH•）、2,2'-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢（AAPH）、水溶性维生素E类似物（Trolox）、维生素C、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、还原型辅酶Ⅰ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠(NADH-Na2)、吩嗪硫酸甲酯（PMS）和硝基四氮唑蓝（NBT）均购自Sigma-Aldrich公司，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亚砜（DMSO）等试剂皆为国产分析纯。大孔吸附树脂购自日本三菱（DIAIONHP20）。1.3仪器酶标仪（美国MD，SpectraMax190）；高速冷冻离心机（德国Sigma，3K18）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司，BS201S）。1.4动物雄性新西兰家兔1只，12～15周龄，体重3.0kg，购自北京富豪实验动物养殖中心。单笼饲养，自由进食饮水。2方法2.1苦菊提取物的制备苦菊干燥全草5.8kg经95%乙醇回流提取3次（80L×2h、70L×1h、68L×1h），过滤合并滤液，减压浓缩所得浸膏混悬于70%乙醇溶液中。混悬液继续经石油醚提取4次（2，1.5，1.5，1.5L），所得到的乙醇层经减压浓缩至无醇味，加水混悬约2.3L，并经乙酸乙酯提取3次(1.5，1.2，1.2L)，提取后所得的水层约2.2L，过大孔吸附树脂，分成水部分（14L）和60%乙醇部分（15L）。其中60%乙醇部分浓缩后挥干得到重约40g的棕色粉状颗粒，即为苦菊提取物。2.2DPPH•清除能力的检测DPPH•清除能力检测的操作步骤根据文献[4]略加调整：反应体系在96孔板中进行，溶于DMSO的待测样品每孔加入20μL，随后迅速加入100μmol/L的DPPH•（溶于无水乙醇）180μL，震荡混匀后采用酶标仪于517nm波长处检测吸光度（A），同时以20μL的DMSO代替待测液作为空白对照，空白调零孔为20μLDMSO和180μL无水乙醇。经过多个时间点的检测，以不再发生改变的A值作为最终测量值。DPPH•清除率的计算公式为：DPPH•清除率＝[1－(As/Ac)]×100％其中，As为待测样品组A值，Ac为空白对照组Abymacroporousresinsuccessively,withethanolaseluent.Afterelutionwith60%ethanol,theeluatewasevaporated,andtheresidueoftheextractwasobtained.Theantioxidantactivityoftheextractwasmeasuredby2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical(DPPH•)andsuperoxideanion(O2-•)scavengingcapacityassays,andbythetestbasedonhaemolysismodelinducedby2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH).ResultsTheextractshowedthecapacityofscavengingradicalsofDPPH•andO2-•,whichwasdependentontheconcentrationofit,anditspowertoscavengeO2-•wasstrongerthanthatofthereferencevitaminC.Meanwhile,theextractinhibitedhaemolysisofrabbiterythrocytesinducedbyAAPHeffectively,indicatingthattheextractwasabletoprotectthecellsandtissuesoforganismfrominjuryinducedbyoxidativestress.ConclusionTheexcellentantioxidantcapacityofetractfromCichoriumendiviaL.providesreferenceforitsapplicationinfoodanddrug.KeyWords:CichoriumendiviaL.;2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical;superoxideradical;erythrocytehemolysis;antioxidantactivity食品与药品FoodandDrug2011年第13卷第03期95值。本实验以DPPH•清除率达到50％时所需待测液的浓度（EC50）作为评价指标。以Trolox作为阳性对照。2.3超氧阴离子清除能力的测定测定O2-•清除能力的操作步骤根据文献[5]略加调整：反应体系在96孔板中进行，反应试剂皆溶于磷酸盐缓冲液（PBS，10mmol/L，pH7.4）。每孔加入一定浓度的待测溶液20μL，以及皆为40μLEDTA-Na2（0.625mmol/L）、NADH-Na2（0.49mmol/L）和NBT（1mmol/L），最后加入能引起以上体系产生O2-•的PMS（0.11mmol/L）60μL，室温放置5min后，在酶标仪于560nm波长处测定A值。结果以O2-•清除率表示，其计算公式为：O2-•清除率＝[1－(As/Ac)]×100％其中，As为待测样品组A值，Ac为空白对照组A值。以维生素C为阳性对照。2.4AAPH诱导的兔血红细胞溶血的测定本检测的操作根据文献[4]略加调整：从新西兰家兔耳中央动脉取血约15mL，置于有若干玻璃珠的三角瓶中振摇10min，加PBS（10mmol/L，pH7.4），摇匀后将混悬液以2500r/