点突变试剂盒SMK-101操作流程详解

08-03KOD-Plus-MutagenesisKit(CodeNo.SMK-101)使用说明书研究用TOYOBOCO.,LTD.LifeScienceDepartmentOSAKAJAPAN目录[１]简介.......................................................................................................................1[２]本试剂盒反向PCR突变的流程.............................................................................2[３]制品内容...............................................................................................................2[３]制品内容...............................................................................................................3[４]注意事项...............................................................................................................3（１）模板用的质粒DNA..........................................................................................3（２）PCR引物的设计和要求...................................................................................4（３）PCR条件...........................................................................................................5（４）PCR过程中的第二位点突变（目标突变以外的突变）...............................5（５）对照质粒...........................................................................................................5[５]操作说明................................................................................................................7（１）反向PCR...........................................................................................................7（２）用DPNI对模板质粒DNA进行消化.................................................................8（３）PCR产物自身环化...........................................................................................8（４）转化...................................................................................................................8（５）突变体的确认...................................................................................................9[６]疑难解答.............................................................................................................10[７]参考资料.............................................................................................................10（１）相关培养基和试剂的组成.............................................................................10（２）相关产品.........................................................................................................11【注意】本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。在使用本产品时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。NOTICETOPURCHASER:LIMITEDLICENSEUseofthisproductiscoveredbyoneormoreofthefollowingUSpatentsandcorrespondingpatentclaimsoutsidetheUS:5,079,352,5,789,224,5,618,711,6,127,155andclaimsoutsidetheUScorrespondingtoUSPatentNo.4,889,818.Thepurchaseofthisproductincludesalimited,non-transferableimmunityfromsuitundertheforegoingpatentclaimsforusingonlythisamountofproductforthepurchaser’sowninternalresearch.Norightunderanyotherpatentclaim(suchasthepatented5’NucleaseProcessclaimsinUSPatentsNos.5,210,015and5,487,972),norighttoperformanypatentedmethod,andnorighttoperformcommercialservicesofanykind,includingwithoutlimitationreportingtheresultsofpurchaser'sactivitiesforafeeorothercommercialconsideration,isconveyedexpressly,byimplication,orbyestoppel.Thisproductisforresearchuseonly.DiagnosticusesunderRochepatentsrequireaseparatelicensefromRoche.FurtherinformationonpurchasinglicensesmaybeobtainedbycontactingtheDirectorofLicensing,AppliedBiosystems,850LincolnCentreDrive,FosterCity,California94404,USA.[１]简介本产品采用高保真的KOD–Plus-酶，通过反向PCR法（InversePCR）进行定点突变。反向PCR法是以环状DNA（如质粒）为模板，以反方向设计的两条引物对质粒进行完整的PCR。这样，通过引物设计导入突变或插入序列，或者在目标缺失序列两侧开始设计引物，从而在PCR产物上产生碱基突变或插入/删除序列，然后将PCR产物自身连接，转化后产生突变后的质粒。本产品特征：1.突变域大由于采用反向PCR法，不但可以实现几个碱基的替换、插入或缺失，还能进行几十个碱基的插入（Tag导入）和数百碱基的缺失。而且，也可以用任一种氨基酸替换特定部位的氨基酸进行饱和突变（SaturationMutagenesis）2.突变的真实性可以得到高达95％的突变体。而且，由于采用KOD–Plus-，并通过优化条件将PCR循环数降至昀低，PCR过程中的第二位点突变（目标突变以外的突变）的可能性极小。对于10kb以上的质粒也可成功进行突变。3.操作简单*使用本试剂盒不需使用磷酸化引物。PCR产物自身环化时，磷酸化反应和连接反应同时进行，包括转化在内一共只需简单的三个步骤。（图1）*专利申请中东洋纺（上海）生物科技有限公司[２]本试剂盒反向PCR突变的流程InversePCR（5-10cycle）0.5～2hr(A)(A)CH3CH3CH3CH3TemplateTemplateCH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3DpnI消化模板DNA37℃，1hr(C)(C)Mutant(D)(D)PCR产物自身环化磷酸化/连接同步进行16℃，1hrMutantCH3CH3CH3CH3CH3Template(B)(B)CH3CH3CH3CH3TemplateCH3CH3CH3CH3TemplateCH3CH3CH3TransformE.coli图1．本试剂盒用反向PCR进行突变的流程(A)质粒DNA模板进行甲基化，在引物上导入突变位点，进行反向PCR。(B)利用DpnI内切酶对甲基化的质粒DNA模板降解。(C)T4多聚磷酸激酶和连接酶同时对PCR产物磷酸化反应和连接，自身环化。(D)昀后PCR产物形成环状质粒，进行转化。垂询电话：[phone][３]制品内容（-20℃保存）名称(20回用＊1)KOD-Plus-（1U/μl）25μl10xBufferforiPCR125μl2mMdNTPs125μlDpnI(10U/μl)50μlT4PolynucleotideKinase(5U/μl）50μlLigationhigh250μlControlPlasmidpAK119M(50ng/μl)10μlControlPrimer#1(10pmol/μl)10μlControlPrimer#2(10pmol/μl)10μl＊1)本试剂盒可进行20个反应，其中包括5个阳性对照反应。＜其它需要的试剂＞z·LB琼脂培养基；z·50mg/ml氨苄青霉素或20mg/ml卡那霉素；z·4％X-Gal和100mMIPTG；（需要蓝白斑筛选时）z·感受态细胞。[４]注意事项（１）模板用的质粒DNA在本试剂盒中，作为模板的质粒DNA必须在转化前用DpnI酶切，以提高突变子的得率。DpnI可专一性识别Gm6ATC序列，只能作用于甲基化或半甲基化的DNA，因此，作为模板的质粒DNA必须经甲基化处理。甲基化可甲基化酶作用而产生，常用的大肠杆菌菌株JM109或DH5a都含有甲基化酶，经这些菌株扩增产生的质粒都是甲基化质粒。如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化，必须通过甲基化酶另外处理或再用JM109等菌株扩增，才能作为模板使用。东洋纺（上海）生物科技有限公司（２）PCR引物的设计和要求①关于设计设计引物时应该遵循常规引物设计的原则，把突变设计入引物。突变部位（模板和引物不互补）应设计在5’端或靠近5’端，引物3’端