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基因芯片技术及其应用李家兴1001080728园艺107基因芯片(genechip,DNAchip,DNAmicroarray又被称为DNA芯片、DNA微阵列和生物芯片,是指以大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针,按照特定的排列方式和特定的手段固定在硅片、载玻片或塑料片上,一个指甲盖大小的芯片上排列的探针可以多达上万个[1-3]。在使用时,先将所研究的样品标记,然后与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交,再用激光共聚焦显微镜等设备对芯片进行扫描,配合计算机软件系统检测杂交信号的强弱,从而高效且大规模地获得相关的生物信息。此项技术将大量的核酸分子同时固定在载体上,一次可检测分析大量的DNA和RNA,解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目标分子数量少、成本高、效率低等的缺点[4]。此外,通过设计不同的探针阵列(array,利用杂交谱重建DNA序列,还可实现杂交测序(sequencingbyhybridization,SBH[5]。目前,该技术在基因表达研究、基因组研究、序列分析及基因诊断等领域已显示出重要的理论和应用价值[6]。1基因芯片技术的产生和发展21世纪将是生命科学的世纪,基因芯片技术是近年产生的一项生物高新技术,它将像计算机一样成为21世纪即将来临的又一次新兴革命的奠基石[7,8]。基因芯片技术的产生与发展与人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP的研究密不可分[9]。人类基因组的大量信息需要有一种快速、敏感、平行检测的技术,随着越来越多的基因被解码,基因的功能研究成为迫切需要解决的课题。在这一背景下,以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生了,它被誉为是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。基因芯片技术充分结合灵活运用了寡核苷酸合成、固相合成、PCR技术、探针标记、分子杂交、大规模集成电路制造技术、荧光显微检测、生物传感器及计算机控制和图像处理等多种技术,体现了生物技术与其他学科相结合的巨大潜力。基因芯片技术的理论基础是核酸杂交理论,Southern印迹可以看作是生物芯片的雏形;其后,人们又发明了一个以膜片为介质基础的克隆库扫描技术,引入了克隆与杂交型号相对应的概念,在此基础上,分格筛选技术得到了应用;1989年EdSouthern提出了利用在玻片表面固定的核苷酸探针进行基因序列测定的实验设计;而真正使基因芯片技术发展并实用化的,是得益于非孔固相支持介质的使用和高密度原位合成核苷酸两项技术的发明,从而推进了基因芯片产品的商业化。在美国硅谷,1991年Affymax公司开始了生物芯片的研制,1992年从Affymax派生出来的世界上第一家专门生产生物芯片的公司Affymetrix宣告成立。Forder(现任Affymetrix总裁及其同事在20世纪90年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法,在此基础上于1993年设计了一种寡核苷酸生物芯片,1996年制造出了第一块商业化的基因芯片。1994年在美国能源部防御研究计划署、俄国科学院和俄国人类基因组计划1000多万美元的资助下研制出了一种生物芯片,用于检测β-地中海贫血病人血样的基因突变。1998年美国的纳米基因公司(Nanogen利用生物芯片在世界上构建了首例缩微芯片实验室,该成果被美国期刊选入1998年世界10大科技突破之中。最近几年,国际上掀起了基因芯片设计热潮,使基因芯片技术得到不断完善和发展,出现了多种芯片技术。最初的芯片主要目标是用于DNA序列的测定、基因表达图谱鉴定及基因突变体的监测和分析,因此称为基因芯片。但目前这一技术已扩展到非核酸领域,如已出现了蛋白质芯片分析技术、Biacore技术和丝网印刷技术等。在这一发展趋势下,芯片技术现多被称为生物芯片技术。根据芯片上固定的探针的不同,可将生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等;根据原理的不同,可以分为元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片;根据所进行的反应过程,可将生物芯片分为生物样品的制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片及PCR毛细管电泳芯片等[10-13]。2基因芯片的技术原理及制作基因芯片技术是分子生物学中常用分子杂交技术的扩展。其基本做法是将大量的核酸片段有规则地固定在某种介质上,制成芯片,然后将要检测的样品加以标记,再与做成的芯片充分杂交,加以洗脱,用图像显示出来。目前适用于制作芯片的载体材料主要有半导体硅片、玻璃片、金属片、各种有机高分子制作的薄膜等,其中以载玻片最常用。基因芯片的制作一般有2种方法,一种为原位合成(insitusynthesis,适用于寡核苷酸;一种为合成后交联(post-syntheticattachment,多用于大片段DNA,有时也适用于寡核苷酸,甚至mRNA。3基因芯片的使用操作基因芯片操作的基本过程如下:分离纯化的生物样品先进行扩增、标记,然后与芯片上的探针阵列杂交,再对杂交信号进行检测与分析,最后得出待测样品的遗传信息。3.1样品的准备从血液或组织中得到的生物样品(DNA或mRNA一般不能与芯片反应,需进行一定程度的扩增,而且对样品中的靶序列(靶分子需进行高效而特异的扩增,以获取样品中的靶分子,如cDNA片段、PCR产物、mRNA、寡核苷酸等。靶分子的标记主要采用荧光标记法,也可用生物素、放射性同位素等标记。样品的标记在其PCR、RT-PCR扩增或逆转录过程中进行。常用荧光色素Cy-3、Cy-5或生物素标记dNTP。DNA聚合酶选择荧光标记的dNTP为底物,参与引物延伸,这样新合成的DNA片段中就掺入了荧光分子。对于cDNA,一般是在反转录过程中掺入荧光基因[25]。3.2分子杂交在此步骤中发生靶标样品核酸分子与(芯片探针之间的选择性反应。芯片杂交属于固-液相杂交,与膜上杂交相似。芯片杂交中固定在芯片上的往往是成千上万的核酸探针,而与之杂交的则是经过标记的核酸样品。待测样品经扩增、标记等处理后,可与基因芯片上探针阵列进行分子杂交。靶分子与探针分子之间的杂交是芯片检测的关键一步,杂交条件因靶分子的类型不同而有所不同。探针的浓度、长度,杂交的温度、时间、离子强度等因素都是影响杂交效果的关键因素。因此,要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交反应条件。杂交后芯片要经过洗涤除去未杂交的一切残留物。3.3信号检测与分析待测样品与基因芯片上探针阵列杂交后,漂洗以除去未杂交分子。携带荧光标记的分子结合在芯片特定的位置上,在激光的激发下,含荧光标记的DNA片段发射荧光。样品与探针严格配对的杂交分子,所产生的荧光强度最强;不完全杂交的(含单个或2个错配碱基双链分子荧光信号弱(不及前者的1/35~1/5;不能杂交的则检测不到荧光信号或只检测到芯片上原有的荧光信号。荧光强度与样品中的靶分子含量有一定的线性关系。芯片上不同位点的荧光信号被荧光共聚焦显微镜、激光扫描仪或落射显微镜等检测到,由计算机记录下来,然后通过特制的软件对每个荧光信号的强度进行定量分析、处理,并与探针阵列的位点进行比较,就可得到待测样品的遗传信息。4基因芯片技术的应用4.1基因表达水平的检测以DNA、cDNA或寡核苷酸为探针制备的DNA芯片,可直接平行检测大量mRNA的丰度,而应用于基因表达的研究。基因芯片应用于基因水平检测的最大优越性是可以自动、快速检测目的材料中成千上万个基因的表达情况,这是常见的基因表达水平检测法不可比的。目前,基因芯片技术已在部分植物、细菌、真菌的整个基因组范围内对基因表达水平进行了快速检测,该技术还可用于检测各种生理、病理条件下人类所有基因表达的状况[26]。4.2基因点突变及多态性检测可根据已知基因的序列信息设计出含有成千上万不同寡核苷酸探针的DNA芯片,再用荧光标记待测DNA,如二者完全匹配则杂交后结合牢固,荧光强度高,如不完全匹配则荧光强弱或无,由此可判断点突变的存在与否及部位和个数。如对N个碱基长度序列的每个碱基进行筛查,则需4N个探针即可。一般1.28cm2的支持物上可载16000个探针,可用于4000kb碱基序列的筛查。5基因芯片技术存在的问题与展望5.1基因芯片技术存在的问题要使芯片成为在实验室及生产实际中普遍采用的技术仍有一些关键问题需要解决,比如,提高芯片的特异性;简化样品制备和标记操作;增加信号检测的灵敏度;降低设备的费用;在一个芯片上存在多种探针,如何选择优化杂交条件;杂交在固相上进行,如何解决空间因素会对杂交造成的不利影响;如何研制和开发高度集成化的样品等。这些问题是当前和今后一段时期内国内外基因芯片技术研究的焦点,同时也是其能否由实验室研究推向应用的关键问题。5.2基因芯片技术展望芯片技术的发展历史很短,虽然还存在一些问题,但它已在基因表达分析、基因诊断、药物筛选、序列分析等诸多领域呈现了广阔的应用前景,而且在农业、工业,以及食品、环境监测等方面也表现出极大的应用潜力。基因芯片技术的迅速发展和应用已引起各方面的广泛关注,许多实验室、公司都在大力开发和应用此项技术,在制作、检测设备及计算机软件等方面均投入了大量的人力和物力进行研究和开发。可以预见,随着研究的不断深入和技术的更加完善,基因芯片技术的应用将更加广泛,一定会在生命科学研究领域发挥巨大的作用[26-28]。参考文献[1]BertrandL,AsaphA,MarkS.OverviewofDNAchiptechnology[J].MolecularBreeding,1998,4:277[2]GoffeauA.Molecularfishonchips[J].Nature,1997,385(6613:202[3]CheeM,YangR,HubbelE,etal.Accessinggeneticsinformationwithhig-densityDNAarrays[J].Science,1996,274:610[4]WuJ,SmithL,PlassTC.Chip-chipcomesofageforgenomewidefunctionalanalysis[J].CancerRes,2006,66(14:6899[5]LockhartDJ,DongH,ByrneMC,etal.Expressionmonitoringbyhybridizationtohigh-densityoligonucleotidearrays[J].NatBiotechnol,1996,14:1675[6]LeeM,YangR,HubbelE,etal.Accessinggeneticsinformationwithhig-densityDNAarrays[J].Science,1996,274:610[7]BrowP,HartwellL.Genomicsandhumandisease-variationsonvariation[J].NatGenet,1998,18(1:91[8]IsraelDA,SalamaN,ArnoldCN,etal.Helicobacterpyloristrainspecificdifferencesingeneticcontentidentifiedbymicroarray,influencehostinflammatoryresponses[J].JClinInvest,2001,107:611[9]AlonU,BarkaiN,NottermanDA,etal.Broadpatternsofgeneexpressionrevealedbyclusteringanalysisoftumorandnormalcolontissuesprobedbyoligonucleotidearrays[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:6745[10]HoSW,JonaG,ChenCT.LinkingDNA-bindingproteinstotheirrecognitionsequencesbyusingproteinmicroarrays[J].ProcNatlAca