基因芯片

基因芯片操作技术基因芯片（genechip），是一块带有DNA微阵列（microarray）的特殊玻璃片或硅芯片片，在数平方厘米之面积上布放数千或数万个核酸探针；检体中的DNA、cDNA、RNA等与探针结合后，借由荧光或电流等方式侦测。经由一次测验，即可提供大量基因序列相关信息。它是基因组学和遗传学研究的工具。研究人员应用基因芯片就可以在同一时间定量的分析大量（成千上万个）的基因表达，具有快速、精确、低成本之生物分析检验能力。基因芯片基因芯片分析原理基因表达水平的检测基因诊断药物筛选个体化医疗测序生物信息学研究基因芯片技术应用微阵列技术（microarray）原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸），并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。基因表达谱分析基因表达系列分析（Serialanalysisofgeneexpression,SAGE）基本原理是：每一条mRNA序列都可以用它包含的9bp的小片段（TAG）代替，因此考查这些TAGs出现的频率就能知道每一种mRNA的丰度。基因表达谱分析差异展示PCR（DifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR,DDRT-PCR）基本原理是扩增反转录产物得到分子量大小不同的cDNA片段。首先利用oligo（dT）引物反转录mRNA得到cDNA，然后利用相同的oligo（dT）引物和另一随机引物进行PCR扩增。基因表达谱分析抑制消减杂交（SuppressionSubtractiveHybridization,SSH）该方法是以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法。所谓抑制PCR，是利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增。基因表达谱分析基因组作图测序基因检定基因功能分析基因组分析中的基因芯片技术合成寡聚核苷酸片段制备基因芯片用于质量控制的靶序列其他生物芯片的原料基因芯片制备的原料荧光素的分类按照荧光染料分子标记生物大分子的方式：含有活性基团的荧光染料、嵌入式荧光染料。按照荧光染料的用途：蛋白质分析用荧光染料、核酸分析用荧光染料。按照荧光染料的化学反应特性不同：碱性荧光染料、酸性荧光染料、中性荧光染料。基因芯片杂交样品的荧光标记技术原理是荧光标记试剂与蛋白质所带的巯基、氨基及羧基等基团发生置换或缩合反应连接在一起。荧光素类及其衍生物：荧光素类染料的活性基团R3易与被标记分子中的-NH2、-OH、-SH等结合，如FITC（R1=R2=H，R3=-NCS)中的-NCS易与蛋白质中的-NH2结合，使其应用于蛋白质分析。罗丹明类：在标记反应中活性基团大多与-NH2结合。菁染料：常用荧光标记物的化学原理不同标记方法直接标记(directlabeling)是采用酶学或化学手段，通过荧光染料直接与样品核苷或磷酸戊糖骨架共价结合，杂交后直接检测荧光信号。间接标记(indirectlabeling)：是通过利用树状聚合物分子、抗体或其他试剂把荧光染料分子以非共价和间接的方式连接到样品分子上，杂交后对偶联染料进行检测。利用Klenow聚合酶标记其他标记方法荧光标记的过程直接标记和间接标记流程图不同的标记分子标记分子为RNA：采用反转录将荧光染料标记的核苷酸掺入到新合成的cDNA分子中。1.样品总RNA的提取。2.mRNA的分离和纯化。3.反转录生成cDNA。标记分子为DNA：用荧光染料进行标记。荧光标记的过程基因芯片样品的处理过程RNA的纯化过程：样品的前处理RNA粗提酶处理RNA的分离纯化RNA粗提：机械方法：低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等化学试剂法：在一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂、蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。酶作用法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。RNA的浓缩RNA的鉴定RNA的保存RNA分子降解的防范基因芯片样品的处理过程避免外源RNase的污染操作的规范化将组织立即冻存在液氮中同样，为了最大限度地减少RNA的降解，组织块要足够小以保证整个组织迅速彻底地冷冻抑制内源性RNase的活力RNA提取方法的选择RNA纯化的目的：目标1：选择合适的细胞膜溶解方法。目标2：保证能够抑制所有核糖核酸酶。目标3：选择一种方法去除样品蛋白质。目标4：选择核酸浓缩的方法。目标5：选择合适的储存条件保存纯化的RNA。基因芯片样品的处理过程提取RNA的操作关键五个关键：①有效地破碎样品细胞或组织，尤其是植物细胞有厚厚的细胞壁保护，研磨需彻底；②有效地使核蛋白复合体变性解离，释放出RNA，主要采用的变性剂有异硫氰酸胍(GTC)、N-十二烷基肌氨酸钠（十二烷酰肌氨酸钠）等；③有效地抑制外源及内源RNA酶活性，在提取液中除了加异硫氰酸胍等蛋白质变性剂，还要使用β-巯基乙醇等抗氧化剂减少细胞内氧化酶对RNA的可能的不利影响；④有效地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。基因芯片样品的处理过程RNA提取的过程主要采用两种途径：①先提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来。这种方法会导致小分子RNA(如5SrRNA，tRNA)的丢失；②直接在酸性条件下用酚/氯仿混合液抽提。异硫氰酸胍(GTC)和十二烷酰肌氨酸钠联合使用，使核蛋白复合体解离，RNA释放到溶液中，采用酸性酚/氯仿混合液抽提，低pH值的酚使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离，水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。基因芯片样品的处理过程纯化RNA的鉴定一．RNA的质量控制：（一）浓度的鉴定（二）纯度鉴定（三）完整性鉴定二．核酸的保存：（一）DNA的保存（二）RNA的保存基因芯片样品的处理过程样品准备过程中的注意事项一、在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。二、使用正确的细胞或组织储存条件三、彻底匀浆样品四、在RNA提取之前预处理样品裂解液五、选择最好的RNA分离方法六、DNase处理七、减少环境RNase的暴露八、正确的沉淀九、重悬十、储存基因芯片样品的处理过程转录序列的成分分析用于基因表达谱分析的待测样品标记RNA标记方法的选择理想的RNA标记方法应符合以下要求：①操作简单，灵敏度高；②不影响碱基配对的特异性；③不影响RNA活性；④对酶促反应活性无影响或影响不大；⑤检测方法具有高度灵敏性和高度特异性；⑥标记物对人体无害。用于基因表达谱分析的待测样品标记RNA标记方法的选择1.直接标记法2.间接标记法3.随机引物延伸法4.其他用于基因表达谱分析的待测样品标记RNA标记过程一、5´端标记二、3´端标记三、掺入法标记四、实验材料用于基因表达谱分析的待测样品标记酶介导的标记过程1.引物和mRNA复性2.合成第一链cDNA3.RNA的水解4.荧光标记cDNA的纯化和浓缩5.检查标记cDNA的质量用于基因表达谱分析的待测样品标记cDNA逆转录过程中的标记过程具体操作步骤如下：在离心管中加入：1、10μg总RNA（或2μgmRNA）2、2μgoligo（dT）12-183、加DEPC-H2O至总体积10μl二、将上述混合液于70°C加热10min，迅速置冰上冷却1min三、加入以下混合液：1、标记反应混合液300μl取15μl（1）5×逆转录缓冲液60μl（2）5mmol/LDTT60μl（3）100μmol/LdATP1.5μl（4）100μmol/LdCTP1.5μl（5）100μmol/LdGTP1.5μl（6）100mmol/LdTTP0.3μl（7）DEPC-H2O175.2μl2、Cy3-/Cy5-dUTP（1mmol/L）3μl3、SuperscriptTMII逆转录酶（200U/μl）2μl用于基因表达谱分析的待测样品标记四、混匀，42°C保温2h五、逆转录标记反应完成以后，将样品离心到管底，加入1.5μl20mmol/LEDTA终止反应六、加1.5μl500mmol/LNaOH，70°C加热10min降解RNA七、加1.5μl500mmol/LHCl中和NaOH八、用玻璃纤维过滤柱除去没有标记上的荧光核苷酸，用50μl/pH8.0的TE洗脱纯化产物，并真空干燥九、将标记探针溶于10μlDEPC处理的H2O中。用于基因表达谱分析的待测样品标记转录后cDNA的标记具体步骤如下：在利于全长cDNA合成的条件下利用未修饰的dNTPs进行反转录反应。二、将DNA聚合酶、RNaseH、大肠杆菌DNA连接酶和dNTPs与第一链cDNA混合完成第二链合成。三、以产生的双链cDNA为模板，利用高浓度的合适的DNA聚合酶如具有外切酶活性的Klenow酶进行标准的随机引物标记反应，生成完整双链cDNA的标记产物。这一步可以采用然后偶联的dNTPs直接标记，也可以通过氨基化的dNTP间接标记。用于基因表达谱分析的待测样品标记RNA扩增标记过程1.基于T7的mRNA线性扩增2.多次线性扩增3.限制性标记方法用于基因表达谱分析的待测样品标记基因表达谱的代表性用于基因表达谱分析的待测样品标记随机引物标记过程cDNA样品的随机引物延伸标记用于基因表达谱分析的待测样品标记直接法化学标记过程直接法标记法荧光探针的制备直接标记法的优点是快速、简单，便于大规模的分析样品。缺点是所需的样本量很大，为25~100µg的总RNA或0.5~2µg的mRNA，这使得组织来源受限的实验难以进行。用于基因表达谱分析的待测样品标记用于标记探针质控的层析技术标记核酸的定量计算标记探针的纯化标记待杂交样品的质控分析标记探针的质控后面只做了目录(_)~~~基因芯片杂交过程概述预杂交过程芯片的分子杂交杂交后清洗的严谨度控制基因芯片片基与杂交后清洗基因芯片杂交过程杂交炉的应用原理常用杂交炉的选择杂交过程的监测基因芯片杂交过程基因芯片荧光扫描仪的原理扫描系统的构建激发光的种类发射光的收集信号检测与放大系统工作效率的确定荧光与波长滤片的选择用于提升敏感性与线性区间效率的发射光滤片的选择选择荧光与滤片的基本原理常用基因芯片扫描仪用于杂交信息检测的基因芯片荧光扫描仪系统基因芯片实验设计基因芯片数据分析原理基因芯片杂交图像的分析芯片实验过程中的对照设计基因芯片数据分析常用软件与操作基因芯片实验的设计与数据分析基因芯片实验系统的优化基因芯片实验的设计与实施基因芯片数据分析基因芯片杂交过程膜基因微陈列的出现原位显微光蚀刻与原位合成技术直接打印技术基因芯片技术与3D打印纳米技术与基因芯片技术组织芯片技术的发展电磁基因芯片的可能生物传感器微阵列的前景基因芯片技术的临床应用基因芯片技术在基因测序中的应用基因芯片应用前景基因芯片发展大事记