基因芯片

生物芯片生物芯片：将大量生物分子按预先设计的排列固定于一种载体表面，利用生物分子的特异性亲和反应，来分析各种生物分子存在的量的一种技术。核酸芯片：指采用一定的技术将许多特定的DNA序列排列固定于固相支持物表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行和高效的检测和分析。载体：用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体。寡核苷酸芯片（oligochip）：是把寡核苷酸固定在玻片上，与荧光标记的待检序列在一定条件下杂交，经洗涤后扫描获得检测信息。cDNA：是与mRNA互补的DNA分子，长约0.2-5.0kb。cDNA微阵列芯片：是由固定于基质材料上的cDNA片段组成的微阵列，待测样品标记后与芯片上的探针分子杂交，通过荧光强度的检测对杂交结果进行分析。表达谱基因芯片：用来检测样本中RNA/mRNA，即基因表达（转录水平）的研究芯片。蛋白质芯片技术:狭义的概念：蛋白质芯片是由固定于载体上的蛋白质微阵列组成，然后与要检测的组织或细胞的混合物进行杂交，在通过自动化仪器分析得到的结果。广义的概念：能对蛋白质进行快速、并行分析的生物芯片都可称之为蛋白质芯片探针：狭义：蛋白质或多肽。广义：核酸、核酸-蛋白复合物或其他配基组织芯片(tissuechip)：又称为组织微阵列(tissuemicroarrays，TMA)，是将成百上千个不同组织标本按预先设计的排列固定在一张固相载体上形成组织微阵列，用不同的基因探针或抗体与之杂交，以分析目的基因在相关的组织中表达的差异性。荧光：是从一种被激发光照射的荧光团发射出来的。斯托克斯位移（Stokesshift）：激发峰与发射峰之间的波长差光漂白（Photobleaching)：指荧光染料分子在激发光的照射下，其产生荧光的强度随着时间的延长逐渐变弱消失的过程。灵敏度:指扫描仪测定最微弱荧光的能力第一章生物芯片概述生物芯片的分类根据生物芯片的结构特点分为：微阵列芯片和微流控芯片。（狭义生物芯片包括微阵列芯片:DNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片；广义生物芯片包括微阵列芯片和微流控芯片：毛细管电泳芯片，PCR反应芯片，介电电泳芯片。）根据用途不同分为：生物电子芯片+生物分析芯片生物分析芯片分为被动式生物芯片和主动式生物芯片。被动式生物芯片包括DNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片。主动式生物芯片分为微流控芯片和其他主动式芯片。二、生物芯片的研究概况生物芯片的发展最初级的生物芯片DNA芯片1991寡核苷酸芯片1994测序芯片1995cDNA芯片其他生物芯片生物芯片技术研究存在的问题重复性（稳定性）提高灵敏度增强标准化实现设备及软件完善操作过程简化三、生物芯片技术的基础知识生物芯片技术工作的总流程生物芯片的制备总流程图—芯片的准备+样品的准备芯片的准备—直接购买+自行设计定做+自制；样品的制备—待测样品的纯化、标记；—杂交—检测与分析生物芯片技术主要包括四个基本技术环节：芯片制备、样品制备、生物分子反应、信号的检测与分析生物芯片的制备步骤有哪些？分别有什么目的？基片处理、点样、固定、封闭第二章核酸芯片一、核酸芯片简介概念：核酸芯片是指采用一定的技术将许多特定的DNA序列排列固定于固相支持物表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行和高效的检测和分析。二、核酸芯片的载体载体概念：用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体。如何选择载体？载体表面必须具有可进行化学反应的活性基团，以便于生物分子进行偶联。使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量载体应当是惰性的和有足够的稳定性载体具有良好的生物兼容性，以利于制作不同种类的芯片。载体类型：玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜、塑料等三、寡核苷酸芯片技术oligonucleotidemicroarrayoligochip概念：寡核苷酸芯片是把寡核苷酸固定在玻片上，与荧光标记的待检序列在一定条件下杂交，经洗涤后扫描获得检测信息。制作技术与原理：原位合成：光引导原位合成；压电打印法；分子印章法（适合商品化规模化的高密度基因芯片制备和应用领域）合成后微点样技术：接触式；非接触式（用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中低密度芯片制备）原位合成原理（略）合成后微点样原理利用手工或自动点样装置将预先合成和纯化的寡核苷酸点在经特殊处理的载体上即可。包括接触式与非接触式两种，主要用于中低密度芯片制备点样方式及点样针分为接触式点样和非接触式点样接触式点样:实心针；裂缝针；圈套针（钨，不锈钢，钛，镍等）思考题：比较三种针的优缺点？使用裂缝针时，如果看到玻片上某些点没有点上，分析可能的原因?点印完以后，含有斑点的区域必须加以行列标志，为什么？如何保存？点样的后期处理目的：为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果（特别是背景）造成影响。小结：寡核苷酸芯片的基本概念寡核苷酸芯片的制备原理光引导原位合成点样针及点样过程四、cDNA微阵列芯片cDNA是与mRNA互补的DNA分子，长约0.2-5.0kb。cDNA微阵列芯片是由固定于基质材料上的cDNA片段组成的微阵列，待测样品标记后与芯片上的探针分子杂交，通过荧光强度的检测对杂交结果进行分析。主要内容:cDNA文库的构建提高cDNA文库构建的效率cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一条cDNA合成双链cDNA合成双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA文库构建效率cDNA文库构建的效率低的表现？造成这种低效率的主要原因？如何提高cDNA文库构建的效率？表达谱基因芯片：用来检测样本中RNA/mRNA，即基因表达（转录水平）的研究芯片。将待测样品（处理组）与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片的探针进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。表达谱研究的方式：基因表达丰度的绝对检测基因表达发生变化的相对检测第三章蛋白芯片二、蛋白质芯片技术的概念狭义的概念：蛋白质芯片是由固定于载体上的蛋白质微阵列组成，然后与要检测的组织或细胞的混合物进行杂交，在通过自动化仪器分析得到的结果。广义的概念：能对蛋白质进行快速、并行分析的生物芯片都可称之为蛋白质芯片三、蛋白质芯片的分类根据应用目的：蛋白质功能芯片+蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片研究DNA-protein、RNA-protein、protein-protein等相互作用的的芯片用来检测蛋白质的生物活性蛋白质检测芯片（蛋白质分析芯片、蛋白质表达芯片）主要用于识别检测复杂生物样品溶液中的目标多肽四、蛋白质芯片制备及分析1、载体的选择-玻璃胺反应性表面适用于蛋白的点样巯基反应性表面适合免疫球蛋白G抗体的点样疏水性表面（尼龙或硝酸纤维素）也适合作载体，但有更强的非特异性吸附。实验中较好的载体材料：Hydrogel载体（聚丙烯酰胺为基质）FAST以及CAST基片（固化尼龙或硝酸纤维素）2、探针的选择狭义：蛋白质或多肽广义：核酸、核酸-蛋白复合物或其他配基3、探针的固定样品在载体上排布的实现方式大多是先制备好蛋白质样品库，再通过点样系统实现（一般不采用原位合成法）蛋白质的固定方法:1）物理吸附。2）蛋白分子与基片表面形成化学键。3）包埋。4）蛋白分子的表面交联4、生物分子杂交反应缓冲液、温度、时间、离子强度……5、检测分析在扫描前，基片应在空气中充分干燥。扫描和数据的分析与核酸微阵列相似，并遵循各自的流程。五、蛋白质芯片的应用研究蛋白质的表达研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用检测蛋白与小分子物质的作用，例如蛋白质与DNA，RNA分子等。第四章组织芯片一、组织芯片的概念及分类组织芯片(tissuechip)：又称为组织微阵列(tissuemicroarrays，TMA)，是将成百上千个不同组织标本按预先设计的排列固定在一张固相载体上形成组织微阵列，用不同的基因探针或抗体与之杂交，以分析目的基因在相关的组织中表达的差异性。组织芯片的分类：按照组织点样数目的不同低密度(200)中密度(200-600)高密度(600)按照组织来源不同人类组织芯片动物组织芯片植物组织芯片二、组织芯片的制备组织芯片的制备仪主要包括：操作平台、打孔采样装置、定位系统打孔采样装置对供体组织蜡块进行采样，也可对受体蜡块进行打孔定位装置可使受体蜡块线性移动，从而制备出孔径、孔距、孔深完全相同的组织芯片蜡块。组织芯片的制备步骤:芯片微阵列的设计—组织标本块制备+受体石蜡块的制备；构建微阵列—组织芯片的表面处理—制作切片、贴片通过常规制作H-E切片和显微镜检测分析来实现对典型病变部位所在石蜡块的选择和定位组织标本块的妥善保存原因：有助于以后重新评估实验和利用相同的供体重建TMA保存组织标本块的基本信息打孔仪不同孔径的优缺点分析对组织芯片技术有效性的论证组织芯片上微小的组织样本能否代表原组织的情况？直径0.6mm的组织样本并不能完全反应整个组织的情况，但通过在同一组织中不同部位多次取样可以降低误差，TMA技术是一种总体水平上的研究工具，而并不用于个体的研究。已经有很多paper直接比较了TMA技术与常规切片技术，这两种方法的一致性达到90%。第五章生物芯片的检测什么是生物芯片的检测？通过构建一些特殊的检测装置将标记信号转化成可供分析处理的图像数据，以便分析在生物芯片上的生化反应。生物芯片检测的目的是什么？生物芯片检测的目的是将不可见的生物分子的微弱变化通过生物、化学、光学、电子和软件等多学科交叉技术的综合处理，转换成可见的数字图像信号，实现信号的放大、增强和可视化，以便进行科学研究。生物芯片的检测系统是什么？生物芯片扫描仪硬件系统与软件系统荧光：是从一种被激发光照射的荧光团发射出来的。常见的荧光的发射波长总是比激发波长要长。每种染料都有一个荧光光谱与激发光谱在荧光分析中，可利用激发光谱选择灵敏的激发光波长，利用发射光谱选择灵敏的检测波长。斯托克斯位移（Stokesshift）：激发峰与发射峰之间的波长差应用：选择斯托克斯位移较大的荧光染料例如：Cy3：550nm/570nm20nmCy5：649nm/670nm21nm二、生物芯片扫描仪的主要组成部分激发光、发射光收集、空间定位、激发光与发射光识别、荧光探测器三、生物芯片扫描仪检测原理扫描仪的分类根据探测器不同：①PMT扫描仪②CCD扫描仪生物芯片相对与激光器及探测器是否移动来进行扫读：①扫描检测：激光共聚焦扫描仪②固定检测：CCD芯片扫描仪芯片检测中存在的几个问题：洁净的工作环境扫描过程一定要平稳扫描检测要及时？？片子避免多次重复扫描四、有关检测系统的重要参数及扫描过程信噪比得到真是荧光信号的一个重要参数表示方法：信号/噪声两类噪声暗电流噪声：没有光输入时产生的噪声来源于器件的背景噪声发射噪声：光输入过程中产生的噪声来源于光的粒子性所产生的背景噪声光漂白（Photobleaching)指荧光染料分子在激发光的照射下，其产生荧光的强度随着时间的延长逐渐变弱消失的过程。与光漂白有关的因素照射光的强度、照射时间其他因素灵敏度指扫描仪测定最微弱荧光的能力。通常用um2能测定的荧光分子数来表示。为什么要调节仪器的灵敏度？样品的准备阶段：同种染料的不同类型与批次的影响样本本身的影响：不同样本之间的荧光强度变化；同一样本内部，不同基因表达丰度差异如果扫描仪的灵敏度范围设置不当，可能出现的情况：①扫描强度太弱②扫描强度太强像素与分辨率像素：构成图像的最小单元分辨率：单位面积内容纳的像素的数目像素的大小决定了分辨率的高低，像素越大，分辨率越高，分辨率越高则图像越清晰，定量的准确度就越高，可以提供更精细的具有统计意义的数据。扫描过程将杂交、洗脱后的芯片放置于载片台上设置扫描参数粗扫矩阵区域调整扫描参数和扫描区域，进行精确扫描，获得图谱软件分析五、生物芯片图像处理（必考）芯片图像处理的目的？得到芯片上点的强度，并在这些强度的基础上