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羧酸诱导蚕丝蛋白构象转变杨秀琼(华南师范大学化学与环境学院2008级二班)摘要蚕丝的优异力学性能及其在纺织、生物技术、医疗等方面的应用一直是科学们关注的课题，许多年来科学工作者不断探索蚕的吐丝机理。近年来在蚕丝蛋白结构及其构象方面的研究取得了一定的进展，如用醇、高温进行构象诱导，本文将讨论羧酸在丝蛋白构象转变中的作用。介绍了羧酸在丝素蛋白构象转变研究中的研究进展，表明醋酸分子渗透到丝蛋白聚集体中是破坏丝蛋白原有氢键并诱导肽链重排,进而实现构象转变的一个先决条件.，提出了丝蛋白中的水含量是影响醋酸的扩散速度以及丝蛋白多肽链重排速度的一个重要因素.阐述了丝素蛋白的广阔应用前景。关键词蚕丝蛋白β-折叠醋酸构象转变ConformationalChangeofSilkFibroinInducedbyAceticAcidYangXiuqiong(CollegeofChemistryandEnvironment，SouthChinaNormalUniversity，Guangzhou，510006)AbstractScientistshaveexploredthemechanismofsilkwormsilkformanyyearsInrecentyears,silkproteinstructureandconformationoftheresearchhasmadesomeprogress,suchastheuseofalcohol,hightemperaturetoinduceconformation,Thisarticlewilldiscusstheapplicationofcarboxylicacidinsilkproteinchangingconformationalprocess.AnditwillIntroduceaceticacidinthesilkfibroinconformationtransitionoftheresearch,wecanknowthatcarboxylicacidmoleculespenetrateintosilkproteinaggregationisfibrinogenhydrogenbondwiredamageandinductionofpeptide-chainrearrangement,conformationalchangeandthusachieveaprerequisite.Madethesilkproteinistheimpactofwatercontentinthediffusionrateofaceticacidandsilkproteinpolypeptidechainrearrangementisanimportantfactorinspeed.Andthearticlealaoputforwardthebroadapplicationprospectsofsilkfibroinasbiomaterials.Keywordssilkfibroindiffusionβ-sheetdynamicprocess前言：蚕丝是最早被利用的天然蛋白质之一,人类利用蚕丝作为织物的历史已有五千多年.蚕丝以其优异的力学性质和耐热绝缘，光泽鲜亮等优点被誉为“纤维皇后”，一直是科学家们关注的课题。近年来蚕丝因其优异的力学性能[1]和良好的生物相容性使它在生物医药等高新技术领域日益受到重视,将蚕丝溶解再生后,所得的再生丝素蛋白经过各种加工工艺,可制备成多种形态的材料,如丝蛋白无纺布、纳米微球、多孔支架和复合材料等[1～4],以满足其在生物医药、化妆品、食品和光学等领域的需要[5.6].可以通过改变温度、溶剂极性、溶液pH和应力作用等方式对丝蛋白的结构进行改变，但是每种方式都存在第一的缺陷，本文将研究用醋酸进行丝蛋白构象的转变，并用时间分辨红外光谱进行检测，结合其他仪器分析方法，从而更好地实现丝蛋白构象的转变。1．丝蛋白的结构研究表明，蚕丝蛋白的晶型有3种：silkI、silkII[7]silkIII，如图1。silkI是一种亚稳定的丝结构，立体构象为曲柄形或S形的锯齿构型，整性相对较差且不稳定,容易被破坏，受各种因素的影响容易转变成silkII，silkII的晶体结构是反平行的β折叠结构链堆砌而成,具有很好的规整性,在丝素蛋白的各种构象中最稳定[8]SilkIII是近年来发现的3一折叠螺旋结晶[9]是不同于SilkI和SilkII的一种新型结晶，将其称之为SilkIII晶型，其结晶序列为(Gly—Ala—Gly—Ala—Gly—Ser)，近似为3一折叠螺旋构型。TEM观察其为六方形薄片晶，属斜方晶系，如下图2。在3种晶型中silkII是丝素蛋白的主要晶型，是蚕丝蛋白具有高弹性模量和强度的主要原因。前两种晶型的蚕丝蛋白可以通过丝素蛋白溶液去除溶剂结晶后获得。从SilkI到SilkII的结构转变可以通过改变温度、溶剂极性、溶液pH和应力作用加以完成。而且丝素蛋白象转变是一切蛋白的共同现象。图2SilkIII六方形微晶蚕丝的主体一丝素(fibroin)是由蚕丝后部丝腺合成分泌的浓度为12％的凝胶状溶液，构象为SilkI(主要是无规线团为主,少量转角，a一螺旋)，而纤维状的丝中丝素蛋白为SilkII(主要是β一折叠)。中部丝腺后区分泌内层丝胶，中部丝腺中区的细胞分泌中层丝胶，中层丝胶泌人腺腔时，正好堆积在由后区运送来的液态丝素蛋白柱表面，中部丝腺前区细胞只分泌外层丝胶，外层丝胶泌人腺腔，堆积在由中区运送过来的液态丝素蛋白柱表面。前部丝腺不分泌丝物质起着将中部、后部丝腺分泌的液态绢丝输送到吐丝管导管的作用，由共通部、压丝部、吐丝孔三部分组成。丝蛋白在挤出进程中受到的应力作用,使其构象发生了转变,由无规线团,螺旋向β-折叠构象转化。2、目前诱导丝蛋白构象转变的研究：2.1金属元素诱导丝蛋白构象转变前期的研究中也已报道桑蚕腺体和丝纤维中至少含有钠、钾、镁、钙、铜、锌、铁和锰8种金属元素[10]对于前6种金属元素在桑蚕吐丝过程中的作用进行了比较详细的研究[11-13](II)，Zn(II),Mg(II)有利于诱导丝蛋白折叠构象的形成，Ca(II)有利于维持丝蛋白在溶液中的稳定结构，而K(I)Na(I)则会破坏这种稳定结构[14-16]。2．2醇诱导丝蛋白构象转变甲醇和乙醇是诱导丝素蛋白溶液结晶的主要溶剂，其结晶机理是：醇类由于其自身的极性吸引丝素蛋白溶液中的水分，即水合作用很强，促使憎水氨基酸基团积聚，如丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)，由于这两种氨基酸基团是丝素蛋白结晶区域的重要组成部分，其Gly—Ala长链次序、尺寸决定着丝素蛋白晶区的结构。因此，醇类可以诱导丝素蛋白结晶为SilkII晶型。而且醇类无论在丝素蛋白溶液中，还是在丝素蛋白固态中，都可以诱导其结晶。由于乙醇后处理的局限性,其对膜结构的改变主要集中在表面,因此材料表面的疏水性和SilkII结构的含量都会增加,但是这种后处理对多孔膜整体中SilkII结构含量提高的贡献相对有限。2.3酸环境诱导丝蛋白构象转变溶液的酸碱性对丝素蛋白的结晶也有很大影响，在偏中性和碱性的溶液中，丝素蛋白分子呈无规线团状，当初期的pH5时，干燥后一般会得到SilkII晶体[17]2.4场作用诱导丝蛋白构象转变将丝素蛋白溶液放置于电场中，当电压达到7kV时，丝素蛋白分子链上部分极性链段会在电场力的诱导作用下发生定向排列，形成SilkII结晶。将固态丝素蛋白丝快速抽拉，也会产生SilkII晶型，或者在丝素蛋白溶液中进行搅拌作用，也会形成SilkII晶体[18]。2.5稀土金属配位诱导丝蛋白构象转变稀土金属溶液如硝酸钕、硝酸铈等对丝蛋白溶液的结晶度和溶解性有很大影响。稀土金属离子特有的4f、525d空轨道是良好的电子对接受体，而丝蛋白分子(一COOH、一NH2、一CONH一)中的氧、氮原子中都有孤对电子，是良好的电子对给予体，两者在适当的条件下可形成配位键，从而使形成的丝蛋白膜构象由无规卷曲向折叠结构转变，结晶度得以提高。如果在稀十金属溶液中加入交联剂的话，其结晶度还会进步提高，并且形成的丝蛋白膜的热稳定性也相应有所提高[19]。3、用羧酸诱导丝蛋白构象转变羧酸极性比醇更强，它可以和其他的极性分子形成很强的二次键接，包括氢键。丝素蛋白分子由大量的非极性憎水氨基酸和少量的亲水极性氨基酸组成。因此，非极性的憎水性氨基酸容易积聚在一起。当丝素蛋白分子溶解在极性溶剂中时，对比其水溶液和羧酸溶液，考虑到水的极性比醇和羧酸要弱得多，所以在丝素蛋白水溶液中丝素蛋白分子长链呈现一种松散的无规线团结构，并且有较大的流体力学半径，当干燥后得到的也是无规线团结构，见示意图2（a）。相比之下，羧酸可以与丝素蛋白分子中的极性基团一C0，一OH，COO一，和NH3等反应。因此，在丝素蛋白羧酸溶液中，丝素蛋白分子空间中的非极性基团靠得更近，形成了憎水非极性基团核，这使得丝素蛋白分子更容易缠结在一起，致使其在羧酸溶液中分子堆积尺寸要比在水溶液中小得多，如图3（b）。此外，形成的非极性基团核中主要成分是G1Y和Ala，形成Gly-Ala长链结构，更容易形成β折叠结构，导致SilkII晶型形成。在羧酸中，随着羧基外的残余基团R的复杂性和尺寸的增大，羧酸的极性会降低，诱导丝素蛋白分子结晶的能力也相应降低。经醋酸制备的丝素蛋白溶液不但稳定，放置长时间也不会发生沉淀现象，而且，在去醋酸干燥成膜后得到的固态丝素蛋白的结晶度也很高。但是，醋酸不能使丝素蛋白从溶液中结晶。这是由于醋酸对溶于其中的丝素蛋白分子有双重作用，溶解作用和结晶作用。对醋酸来说，尽管其具有高极性(即高诱导结晶能力)，但其对丝素蛋白分子的溶解能力致使丝素蛋白分子在其中仍是无规线团结构。当除去醋酸后，将丝素蛋白干燥会转变为β折叠结构，形成silkII晶型。对于醋酸对蛋白质等生物材料的这两种相反的作用来说，醋酸可以作为溶剂或晶溶剂。这种特性将会使醋酸在生物材料方面发挥更大的作用。Terry等[20]曾用醋酸和氨水来制造酸和碱的氛围,对蚕丝腺体内水溶性的天然丝蛋白溶胶进行了变性处理并测试其流变性能,结果表明,丝蛋白溶胶在醋酸氛围内(即pH≈2的环境)保持一定时间之后,疏水区域的肽链逐步形成分子内和分子间氢键,发生了向β-折叠构象的转变,从而形成稳定的水不溶性凝胶。醋酸质子化,更容易发生迁移，较多的结合水将提供较大的自由体积,这不仅利于醋酸的渗入,也有利于肽链运动和重排.醋酸与丝蛋白接触并发生相互作用是丝蛋白构象转变的直接诱因.化学试剂(包括水)对膜的溶胀是使分子链获得运动能力是一个主要原因,当外部环境中存在能够使原有氢键作用发生削弱或部分破坏,但又不至于完全破坏(如分解、溶解等)的因素时,丝蛋白就有可能由原先的无规线团或螺旋结构转变为β-折叠。具有强极性羧酸基团的醋酸能通过破坏蛋白质氢键而使膜溶胀。羧酸来源广泛、价格低廉，并且不会产生污染，更有利于蚕丝诱导丝蛋白构象转变，形成silk（II）晶体。图3丝素蛋白长链在不同溶剂中的链状态及干燥后的结构4、TimeResolvedFTIR对羧酸诱导丝蛋白构象进行检测反映物质红外吸收强度随时间变化而变化的谱学手段被称作“时间分辨傅立叶变换红外光谱”(TimeResolvedFTIR,TR-FTIR)[21-22]器技术的发展,TR-FTIR已经成为研究化学及生物体系反应机理的重要方法之一[23-24].人们通常采用温度、浓度、压力和化学处理等外界因素诱导体系变化,并利用TR-FTIR来实现对体系动态过程的监测.由于该测试方法能够突显体系红外吸收谱带的变化趋势,近年来已被应用于蛋白质分子构象转变研究[13～15].与常用的透射光谱测试不同的是,全反射光谱测试仅针对样品的单一表面,这对考察其他物质从另一面渗入样品(特别是膜样品)所引起的变化极为有利,如:水在高分子膜中的扩散过程及机理[16].我们用直接浇铸法将再生丝蛋白膜紧密覆盖于光学晶体表面,并将膜的一面暴露于醋酸氛围中,原位检测光谱吸收随时间的变化,以记录