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1拉曼光谱汇报人：戴吟臻学号：199201911529062拉曼光谱的产生与基本原理拉曼光谱仪的组成拉曼光谱技术的发展现状拉曼光谱在生物医学中的应用目录Contents拉曼光谱分析方法概述3一、拉曼光谱的产生与基本原理41、拉曼光谱的产生1928年,印度物理学家拉曼（C.V.Raman）研究苯的时候发现，当光照射到某些物质上后,其散射光除了有与入射光频率相同的谱线外，还有与入射光频率发生位移且强度极弱的谱线。52、拉曼光谱的基本原理瑞利散射：与入射光频率相同的散射，强度约为入射光的10-3倍拉曼散射：与入射光频率不同的散射，强度约为入射光的10-6~10-8倍62、拉曼光谱的基本原理瑞利散射斯托克斯线反斯托克斯线斯托克斯线：散射光频率小于入射光频率反斯托克斯线：散射光频率大于入射光频率频率之差Δν,为拉曼位移72、拉曼光谱的基本原理拉曼位移与入射光的频率无关，只与物质分子的振动和转动能级有关，不同物质分子具有不同的振动和转动能级，有特定的拉曼位移，因此拉曼可以用来鉴定物质结构的分析和研究8拉漫光谱特征量拉曼散射强度拉曼位移退偏比分子结构和定性分析的重要表征参量3、拉曼光谱的特征量斯托克斯强度较反斯托克斯强，多以其为信号光，定量分析等激光与分子作用，散射光的偏振方向发生变化，提供分子内部结构及对称性信息9激光拉曼光谱仪在性能方面日臻完善,如:美国Spex公司和英国Reinshaw公司相继推出了拉曼探针共焦激光拉曼光谱仪,可以过滤掉反射激光及瑞利散射光；可以进行类似生物切片的激光拉曼扫描,从而得出样品在不同深度时的拉曼光谱。19世纪80年代以来60年代激光光源的问世,光电讯号转换器件的发展给拉曼光谱带来转机。相继推出了许多激光拉曼光谱仪,此时拉曼光谱的应用领域不断拓宽。70年代中期,激光拉曼探针的出现,给微区分析注入活力。19世纪60年代19世纪30年代30年代拉曼光谱曾是研究分子结构的主要手段,此时拉曼光谱仪是以汞弧灯为光源,物质产生的拉曼散射谱线极其微弱,应用受到限制,尤其是红外光谱的出现,使得拉曼光谱在分子结构分析中的地位一落千丈。4、拉曼光谱的发展历史10二、拉曼光谱仪的组成11二、拉曼光谱仪的组成光源外光路系统样品池接收系统计算机12光源提供单色性好、功率大并且最好能多波长工作的入射光激光单色性好、方向性强、光强大，成为拉曼光谱仪的主要光源多用连续式气体激光器，如He-Ne激光器，Ar、Kr离子激光器等激光光源发源具有足够的输出功率和稳定性13二、拉曼光谱仪的组成光源外光路系统样品池接收系统计算机14外光路系统外光路部分包括聚光、集光、样品架、滤光和偏振等部件聚光：在激光器之后，用一块或二块会聚透镜，使激光整流准确地聚集在样品上，照射到样品上的功率提高约一千倍15外光路系统集光：常用透镜组或反射凹面镜作散射光的收集镜。通常是由相对孔径数值在1左右的透镜组成。滤光：抑制杂散光以提高拉曼散射的信噪比，常用前置单色器或干涉滤光片。可以滤去不需要的瑞利线的一大部分能量，提高拉曼散射相对强度。偏振：在光谱仪入射狭缝前加入检偏器，可以改变进入光谱仪的散射光的偏振；在检偏器后设置偏振扰乱器，可以消除光谱仪的退偏干扰。16二、拉曼光谱仪的组成光源外光路系统样品池接收系统计算机17接收系统、计算机接收系统：拉曼散射信号的接收类型分单通道和多通道接收两种。光电倍增管接收就是单通道接收、CCD（可全谱分析）计算机：对拉曼光谱信号进行分析处理18三、拉曼光谱技术的发展现状191、傅里叶变换拉曼光谱技术探测器（干涉图）试样的拉曼散射光通过干涉仪进入探测器，获得干涉图，随后进行傅里叶变换得到拉曼光谱。克服了荧光干扰，具有测量波段宽、热效应小、光谱频率精度高及灵敏度高等优点，且具有多通路的特点，能同时测定所有频率。适用荧光强、颜色深的样品。王斌等利用Fl.-Raman光谱仪对蛋白质样品进行多次扫描,再用曲线拟合原始光谱图,并以子峰面积表征对应的二级结构含量,然后对蛋白质二级结构进行定量分析,同时依据人体正常组织和病变组织的FT-Raman光谱差异,在分子水平上鉴别和研究了病变的起因。傅立叶变换拉曼光谱技术20吸附在粗糙化金属表面的化合物由于表面局域等离子激元被激发所引起的电磁增强，以及粗糙表面上的原子簇及吸附其上的分子构成拉曼增强的活性点，使被测定物的拉曼散射产生极大的增强效应。其增强因子可达103～107，常用增强金属有Ag、Au等。能够有效地分析化合物在界面的吸附取向、吸附态的变化、界面信息等。仇立群等将具有强SERS信号的金纳米粒子作为标记抗体,并将SERS标记的免疫金溶胶作为探针,结合扫描电镜技术,对免疫球蛋白羊抗小鼠lgG分子与银基底的相互作用进行了研究,由于此项技术能够准确控制并全面了解免疫球蛋白IgG在固相基底表面的吸附作用,因而对于医学免疫的检测具有极其重要的意义.表面增强拉曼光谱技术2、表面增强拉曼光谱技术21当待测分子的某个电子吸收峰与激光频率相接近或重合时,这一分子的某个或几个特征拉曼谱的强度可达到正常拉曼谱强度的104~106倍,产生了强度可与基频相比拟的泛音和组合振动光谱,即激光共振拉曼光谱(RRS)。其灵敏度高,可用于低浓度和微量样品的检测,特别适用于生物大分子样品的检测。采用共振拉曼偏振测量技术,不加任何处理就可以得到到人体体液的拉曼谱图，许多生物分子的电子吸收带位于紫外区，Wen等在生物样品的紫外共振拉曼光谱方面进行了研究，利用紫外共振拉曼技术先后研究了蛋白质、核酸、DNA、丝状病毒粒子、牛细胞色素氧化酶等,并获得了许多关于生物大分子结构方面的信息激光共振拉曼光谱技术3、激光共振拉曼光谱技术22共焦显微拉曼光谱仪在光路中引进了共焦显微镜而形成空间滤波,消除来自样品的离焦区域的杂散光,保证到达探测器的拉曼散射光是激光采样焦点薄层微区的信号。显微共焦拉曼光谱仪所测量的样品可以小到um量级。康立丽等对采用显微激光共焦拉曼散射光谱扫描系统对活态红细胞进行拉曼光谱(点测定、线扫描、二维扫描)测定及成像的技术与方法进行了研究共焦显微拉曼光谱技术4、共焦显微拉曼光谱技术231.使用的激光光源性质使其相当容易分析微量样品2.可以对水溶液直接进行测量（水的拉曼光谱很弱）3.光谱的测量范围宽，通常为4000~40cm-14.利用共振拉曼和表面增强拉曼可以提高光谱的灵敏度和选择性，信号信噪比大大提高，已应用于生物、药物等中痕量物质的检测不足之处优越性5、拉曼光谱技术的优缺点1.激光照射样品产生的热效应可使相当数量的有机化合物和生物样品发生热分解作用被破坏2.拉曼散射光较弱，荧光产生的强背景会造成影响3.没有背景测量的绝对强度，易受外界干扰4.目前拉曼的标准谱图库还远没红外光谱库丰富24四、拉曼光谱分析方法概述25光谱预处理光谱特征识别光谱特征提取321四、拉曼光谱分析方法概述261、拉曼光谱预处理去基线，平滑，导数、最大值滤波（排除固定模式噪声），归一化（排除光强、曝光时间等因素的影响）272、拉曼光谱特征提取微分：提高分辨率和灵敏度，增强特征峰主成分分析：对数据进行降维，将数据变换到一个新坐标系统中，使得转换后的新变量互不相关，消除了信息中重叠的部分。得到相应的载荷向量和得分向量。载荷向量即对应于混合物体系光谱中抽提出来的“纯组分”归一化光谱，得分向量理解为“纯组分”在不同样本中的权重，即浓度。高斯拟合：选取已知的特征峰附近一定范围内的光谱数据，将其各自拟合为高斯函数，记录高斯函数中心位置、最大值、半峰宽，作为后续分类的依据。独立成分分析：通过训练得到混合物体系中多个组分的光谱分量（对于有特征峰重叠的情况作用比较明显），并计算光谱在各自分量的投影得分，用于下一步定量/定性分析。283、拉曼光谱特征识别（分类）神经网络：支持向量机…29五、拉曼光谱在生物医学中的应用30三药物成分和结构鉴定二研究人体有意摄入的（药物、探测物）和无意感染（病毒、污染物）物质与人体的相互作用一利用拉曼光谱进行体内和体外的的医学诊断拉曼光谱在生物医学中的应用31拉曼光谱在生物医学中的应用拉曼光谱成为研究恶性肿瘤早期诊断、癌变机理研究的重要手段拉曼手术刀拉曼光谱研究DNA结构变化与浓度变化的关系、DNA的损伤等傅里叶近红外拉曼光谱研究人血红细胞的结构利用拉曼光谱分析进行经皮肤的非入侵式验血技术利用拉曼光谱进行制药监测、药物成分分析等32拉曼光谱应用于肿瘤检测诊断肿瘤检测Sharo等对肝癌组织细胞进行拉曼研究,发现与正常细胞相比,肝癌细胞的拉曼光谱在1040cm-1和1080cm-1处峰的强度较正常细胞的拉曼光谱强度增加,在1241cm-1处峰的强度减弱Lorinez等发现用拉曼光谱分析技术能够区分正常肝组织、有活力的瘤组织和纤维化肝母细胞瘤,研究显示了拉曼光谱技术在临床诊断方面的潜力及应用价值33肿瘤检测人体组织由蛋白质、核酸、碳水化合物和脂类等生物分子组成，在组织癌变过程中,组成组织的各种生物分子只是在不同组织内的构型、构象以及各种成分的构成比例不同，这些早期的变化并不引起临床症状和医学影像学的变化,而拉曼光谱却能从分子水平反映这些变化拉曼光谱应用于肿瘤检测诊断34拉曼光谱应用于肿瘤检测诊断肺组织冰冻切片样品谱带归属表35拉曼手术刀拉曼手术刀目前在恶性病变肿瘤组织如癌症等的外科手术过程中,主要是由有经验的医生判断病灶的位置以及需要切除的部位,并且要借助于病理解剖学及组织细胞学来进行确认利用表面增强拉曼散射原理,将拉曼散射光探针与手术刀结合为一体,手术过程中即时测量人体组织肿瘤的拉曼散射光谱信号,与资料库迅速比对之后,能够确定该组织细胞是否为良性肿瘤或恶性的癌细胞处某一部位的组织36拉曼手术刀37拉曼手术刀使用近红外区波长的的连续激光激发样品,不易产生干扰样品拉曼光谱的荧光激励光通过光纤到达拉曼智能手术刀三角共路型干涉光谱仪38拉曼手术刀39TheEnd