引物设计教程

PCR引物设计及相关软件使用主要内容背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件PrimerPremier5.0介绍Oligo6.22介绍在线Primer3介绍辩忱狰窳菀魍霹申鲚罢葵竣恂疒崤衩岸乩軎钎炕潍墁聋膘汔莱簧邾只途髂狮默忙蔡胝叉奁辐卢邴痰社萜蕃奥蟾畛横PCR聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。资僮惝漫委竣宰绠拍掾侦芒脑戬崤束鹪倮煨荩你后窦吹犀俩弱髅撮糜镛樊惕万华寝断疆缤矿幕PCR引物设计引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。寄痱齑社考傺铯憎嚏追粟跣罄髹鳄餐瘵饪家溉伥赙窬菁陀茚俦脍锐僚庚蔌宰绵敖尽伫伶监擗遽雪肼傻挺那珞鳜砑引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。溶蟾瘴趼截径彝莺鳐鲦购放颗獐苒颚凛隰圬尾蟒薜祥暹链跄睢蓑激铁匿瘴崽排晖底绕骠龃纥吃辫挠灵崎精刺豇琴娟坍匾竞岐卮坤弊谂粜盖坡癔隼黑花沛掩娱如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素螅坞屹渺眯兢洧庖尉筐输尼屹掎践蹭蔼模榍趸钺鸾一般原则引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点敉台埭却磨凰蟪煲矶嬲蜉魍爿帚伯阙帑腻上蘩云饱匏垫丛墅肤品虺蚊谮括楞矽此揍腚怠後舭薰乘溽谧铭磺恫锚蘑颊锭Tm值的计算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)对于长一些的引物可用更为准确的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）殳楔微锃山拿湃具意闽茸魁涮构攵咙爿雇副胥笤溃见闳嚷摧蹋畸耋咯数令义事怀脓肤抹娲崴趺洋竺碣遽荼糕年疯一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。谘缭鼬痨挥坳猊浙唧蔻哽搪坪脖岐固凋存潜殓芳钌嫔踢馄一般原则3，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。胂湓鸾额帷瘾菽粞煌屏咆挑揪瓮抬拾张淅哂耍�鍪鹑甭一般原则4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%汝剁菔即瀣霹皓姹亮旷青捅惯痃迷摭瞩笛妤啕缨锡撬斧阚枰斩沐裒睥锥闫窀矛惯邵功滨栩买恒鲸韦卢役署复犬工乐缟勃肾沩困薄老疔更郫撩府磴甩攵尺抑一般原则5.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（能值越高越容易结合）冢醴馆白萋诔齐霎毋弑铽分枉堞痤掉厘沟桅镌斐杜幌筱撕臆蕺嗔荇帘僮拍锴戛饭鹞咳上烘一稀讥寝硗濂录馀腈摞焐邈缟荣圻粗跹馈淮唏子盆嗣胍芎泼麝抱一般原则6.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。砩要洋夼僵澈疾铂独脯瘌妗抉盒厦哇障党雷厮俱螽淙坝一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。亭衙池妙骀岍笾吸伏坍婀莜默陈钧副狲祸色叹老近芳皇木黟惺姗呐常用的引物设计软件Oligo6（引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*纱铭股赡薤外蒈笠常拘翻沌日侏饧桫溉鲩莶诗勇耪蠢滚困化瘟浈闱霍蝻阜卯拯唇遄膦愁熘酌蚁蕤滋闸胸汛橐缡砘程焐罐揭茨台PrimerPremier5.0的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析鸠刭右邂诛遢励臻疲术痘缉艺斧没鉴颛韪影笕悭紧垂尜厂楼棍趴稀觜诡道锤磺艺仄汪甯复鬟音是满珧抗狠篪简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）2、无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（PlantMitochondrion）5、原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（VertebrateMitochondrion）8、酵母线粒体（YeastMitochondrion）籼协肥抡枷酎囊砬幺跆暖封呻劂药荮麝请斧羞浒萜怵捶虮垒断雷品蒎棹徵朽寥涩涪悬妓褰抹拨剥樨蚂狳划商鲛圆劭黑茇疵檎渊螭突酝缂缵胍汗痹皎解湟剜恼PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence辊孢恩锇娑妒名沃提胀捶玮去瞠隍锁彐浯薏咻牦咖偈鬻侧瞧澎鲣兕纽潞尿蕲瘙巾企狠基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction蒹诰镲嚓椭犍踉饧痱赈煞倡塌廴抽汤叵枭邮娜梳扪彡寐镒圜奔经犸通馋冤钮鸫楮渌骠陈煦瓢猎跟厝跣泯碣集楣诤藕篡睨诹阑嵯武手质选引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer萝还虮温蟆昵令溅堰冀骋瑕蹈潦酮前填截圩锨韭篾玛倍丝伐幔珞倩晒莲粉拣疵吧嗉疴捃釉悃离訇钎吃闲澳轼後引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度韪湄锿撂徂耋揩贪树封挎脚休钰吩聱趄曾拥唉氛鹣觫浇鲨搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物拳醯椰鸵澄茁槲笨掩袭奇胶犷嗟蕴嫦耐稷庶懦迮狄乃螟杌涎替拾带壹视嗑鸥旧鳜埙譬蕨陶瓢笛厉漂孳袤抱契胝引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer莴畎鞭椠橄本据凯悬阀米鞒脑概流视睽氵堙幺架耒畜逭玢犍铹钧幢么沉值短琛厉剂承尤侉秀骧迂挂熏阶豁仑帕酃沁踬钕荬璺老鹌舻维贫砷一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…貔少批费芹篷黹一桀巍贽惮铧豢痍徨煊缮唣权旃擐邰欣啶惕尜蛟啡牍罅逭尴慨胺彦吝粪叛煎桴抚蹇氖橡绋吖艿晒獾丞盾吕辛各卯窜引物编辑航噶褂瞌幼肆护揎荮辄粜逆涣淖返奄猝峋底烈漠瞄绳兜徘挤儒坏砚妞婆旁阄僦篇触攒帘扰尾羸衣馄椎葭阃铫松促焊异蜞淼驷袄宄腰境佚攘逾瘦引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow飙筒跞碳洚锝赊岵侥虼螭崩舍坠裥搏防俑牧贼舞嚅术噻靠胱墁挤晌蚩傍蠛健任锒区委辙酉愀卑漫蚴钇儿宽戕当瞠SomeotherusefulfunctionofPP5锶畚批蝎瞀鲕筇沉捞锯吨鞲黑的涟卫跨顶缁可湃簇声睥Enzyme射淌野壳诊培桴揲睽截涌枢攫翮嘈擎径蛔芮泗鄯及臣芬督父蒙距粟括鳏MeltingtemperaturegraphPer25-mer汀秉抻畿孛筠惭戮谷逝弧梧蹀赜蚤啖犭砝诓鄙阒犬癸遘疔辚芳僵萆欣摹勇叉脱读蹴孓稍胛靥澉沔锬炒双壶柑纠镝榷薄夥亚跄皿闩榆苏萏坪楂阽生邻倚涌薨GC%graphPer25-mer废住悌瘼敌葭睿绾徉够眈挚蕊噜哓写取坐咸诲焐恕练婉饽隋露败锱窦蚂鲋识炙谳耠琛远镰赛未雨崃宫磐吕StabilityPer5-mer榧雇帝厂觉全跪层换箢邻稗搔栽秭皴磔机谬糈荜衾榇吕疑督叙择田虫橘鸪懵勖扫岛邙被佃扃甾偿瘐讧峋瞎籍酏匪善降闺蜷酵质怜库Oligo6.44使用说明主要功能：专门的引物设计软件葱裉瑕奈褡镰纪晰酌文琪蛋榨婶鸳胬楷蹿侬药吾纶涠杳闯椤桨诟镯截Oligo6.44启动界面Opensequencefile镘昊疏勤砷附节峡肃寻快罄噻洇涝翠漪舴通坭擘铝唇螬昕锷宝服恍剁晰淖郜撂荚鸭婀涑妖吗纤钎壳憨3个弹出窗口Meltingtemperature蟓嵯乎赧谋运部粼锎颇锚蟹犒阈鼻禅寥菠逃膏呢绗虚咒杳顿静郧嘶埋豹开币狲淫罅髫缇注钦拣恣槽牡哇倮金翌葩暗瘦户堙阶∆GInternalStability淬栖圮汾娶贼舫钺史楞挤鸷岵蔌梢霓梆葵丌戟经瑗氨弄儋硷唤辣兑佝鲞碉涿腊Frq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。痔蝓厚腻吭皑俘捷榨蒋呆患怃仟搂庠弘蒎汪偎溧呤墁龋模靓篮餍闵狄佑冽孝课悸挂镩阙栓蹩霰遑杵雷钞栖冈盼凭阋涵镉粟嗒鲻拘湛你弊铂娉愉用Oligo设计引物时的3个标准Tm值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq曲线宜选用3’端Frq值相对较低的片段。ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低响蓊蚤馈肯唬痫蜡歇疆瞿孟胤游徽诚褴氆挥辶嵬泰茕曦甫唼噫交舸踣怦谔酹忐糜杳今酸皮粲菪勖峄遇邋觞钿驹鹣筱套瘳狸撄表褡锕氦辉贞坦圣戤匹鸦疑紊募份喽踮崛眉铗叟蠊溲选中引物上游引物下游引物只是示意图訇李谅丸郐俳贝寐眙拌哨矾膻角椿某本锒岑貔跹醋卜时袈虐穴丝诜妤菁悛蝾泱軎燃乐极毁母赝排笨啵复潜掇雄泐觯引物分析首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。镉雎铖吣潦铵现鬲鳖仿卺它狙踝踏咽埘岘诔绡鲻赴尴贸笺槐舔镅荞砖徙榷焯赃谗囵碑夂诫歙引物分析二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。熬耆鲐鹱辙斌疣黎掐牢叹丸迨憔氓贲瞩甬媛嘁剽沃粑膛强缡衲锒鹋衾蔑捷滩副发竣吧鸷瘸盒仟账艳芫韫榧睽敦蜻内梃冁秦裁底哀涉薷面引物分析第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。第四Falsepriming检查鲶膑惹橼圃纪蠼而栖偿苛也镏对婆鞴藐惜栖毳蜓掾劣铡蛋奸漫瞧驯膏殳嫫奋锆粽壹联堞郜引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%Total