5.1基因工程制药

第四章基因工程制药在制药业中，医药产业经历了3个不同的历史阶段:1.天然药物2.通过化学方法合成的药物3.基因工程药物基因工程药物3个阶段:其一是细菌基因工程，即把目的基因通过适当的改建导入大肠杆菌中，再通过细菌等原核微生物表达的目的蛋白作为药物;其二是细胞基因工程药物，这是把人或哺乳动物的基因直接导入哺乳动物的细胞中，生产有生物活性的产品;其三是利用转基因动物生产低成本、高活性的药物。第一节基因工程药物概述第二节基因工程药物的表达第三节基因工程药物的生产第四节基因药物实例——转基因动植物制药发现和确证药物靶标设计新分子产生生物分子库新的生物分子下游工程生物药物制剂新的生物药物生物信息学基因组学功能基因组学蛋白质组学蛋白质工程分子结构和活性的关系蛋白质化学NMR，质谱X光晶体衍射代谢工程糖基化工程天然配基新型生物药物研发流程第一节基因工程药物概述意义：自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。（1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；（4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。一、基因工程技术可生产的药物和制剂二、基因工程技术生产药物的优点（1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的使用范围；（3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。三、我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。α1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过Ⅲ期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称适应症开发及生产单位批准时间重组人干扰素α1b（外用）病毒性角膜炎长春生物制品研究所1989年试生产重组人干扰素α1bHBV、HCV上海生物制品研究所等1996年重组人干扰素α2a尖锐湿疣，疱疹等，HBV、HCV新大洲药业等1997年重组人干扰素α2bHBV、HCV安徽安科生物工程股份有限公司等1997年试生产重组人干扰素γ类风湿丽珠医药（集团）有限公司生物工程公司等1995年试生产重组人白介素2癌症辅助疗法长春生物制品研究所等1997年试生产重组人巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）化疗生白细胞厦门特宝等1997年试生产重组人粒细胞集落刺激因子化疗生白细胞杭州九源基因公司等1996年试生产我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称适应症开发及生产单位批准时间重组尿激酶心肌梗死溶栓医大实业（上海）1996年试生产重组人红细胞生成素（EPO）再生障碍性贫血南京华欣等1997年试生产重组人胰岛素糖尿病通化安泰克1998年重组人生长激素儿童侏儒症长春金赛等1998年试生产重组碱性成纤维细胞生长因子创伤、烧伤珠海东大1996年试生产乙型肝炎疫苗预防乙肝华北制药集团有限责任公司等重组痢疾菌苗预防痢疾军事医学科学院1998年获新药证书重组表皮生长因子创伤外用中国医学科学院基础医学研究所2000年获新药证书四、基因工程药物生产的基本过程定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装上游阶段下游阶段1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。第二节基因工程药物的表达一、药物基因的分离二、基因表达一、药物基因的分离目前基因工程药物大都是人基因片段的蛋白产物，或糖基化修饰后的蛋白产物。真核生物的基因一般包括了若干外显子和内含子。由于内含子不能翻译产物，因此基因工程药物表达所使用的基因通常是cDNA，即mRNA的反转录产物。特定的mRNA可以通过不同的方法获得。A.cDNA文库B.直接从特定的mRNA分离基因C.从蛋白质分离编码基因D.基因的化学合成E.RT-PCR分离基因1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定（一）cDNA文库方法：oligo(DT)亲和层析法一般mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。用放射性探针法检测。以cDNA第一链为模板合成第二链。（1）核酸探针杂交法（2）免疫反应鉴定法用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：a)加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’末端加上互补的同型多聚酶序列。b)人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。限制：（二）化学合成法一、不能合成太长的基因。二、人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难。三、费用高（三）RT-PCR逆转录－聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。二、基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。基因工程重组药物宿主的选择主要考虑产物的活性表达和宿主的安全性。一般的原则是根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高、能稳定传代、受体细胞基因型与载体所含的选择标记需匹配。（一）宿主细胞的选择1、原核细胞2、真核细胞（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌（1）酵母：酿酒酵母应用广泛。（2）丝状真菌（3）哺乳动物细胞（4）植物细胞（二）大肠杆菌中的基因表达1、载体表达载体必须具备的条件：（1）载体能够独立的复制（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记（3）具有很强的启动子（4）具有阻遏子（5）有很强的终止子（6）有翻译的起始信号常用的表达载体：（1）pBV220系统（2）pET系统2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件①启动子的强弱②核糖体结合位点③SD序列和起始密码子ATG的间距④密码子组成3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1）以融合蛋白的表达形式表达药物基因由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质，称为融合蛋白。（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因（3）分泌型表达蛋白药物基因1、载体（1）载体的复制序列——包括YEp类、YRp类、YRp类和YIp类。（2）克隆载体——由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，所以酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。（3）表达载体——包括普通表达载体和精确表达载体。（三）酵母中的基因表达2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率（3）外源蛋白的糖基化（4）宿主菌株的影响表达用的酵母宿主菌应具备：①菌体生长力强。②菌体内蛋白酶要较弱。③菌株性能稳定。④分泌能力强。主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。（四）动物细胞中的基因表达中国仓鼠卵巢细胞（CHO）猴肾细胞（COS）CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR），经转染可将DHFR重组至细胞中，含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤（MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的重组细胞。哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点——能识别和剪切外源基因中的内含子并加工为成熟的mRNA。主要载体SV40衍生载体逆转录病毒载体腺病毒载体（AV）腺相关病毒载体（AVV）痘苗病毒载体（VV）三、基因工程菌的稳定性基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。质粒稳定性的分析方法：1、质粒不稳定产生的原因主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这两种菌的生长比速率差异的大小。二阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。2、提高质粒稳定性的方法第三节基因工程药物的生产一、基因工程药物的生产特点是外源蛋白在宿主细胞内的异源表达，不同于微生物的天然次级代谢药物，因此在调控合成方式上，应该主要受限于质粒或噬菌体的内在性质；是蛋白质产物，不同于种类多样的次级代谢产物；合成途径简单，没有复杂的多酶系统；产物的积累主要在胞内，分泌型也主要积累在细胞周质中；产物在胞内积累通常是以内涵体的形式；分离纯化相对于次级代谢产物而言要简单、一致；产物分离纯化后可能没有活性，需要进一步的复性。基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，因此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可能的扩散污染，必须在合格的GMP生产车间进行。基因工程药物的GMP是对生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，成品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。二、基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程主要包括：（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。1、基因工程菌的培养方式常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。（1）补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2）连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定