β-内酰胺酶残留检测限量标准及定量检测研究优尔齐™β-内酰胺酶残留检测系统介绍1β-内酰胺酶残留问题的由来2β-内酰胺酶残留检测方法综述3乳与乳制品β-内酰胺酶残留限量标准4β-内酰胺酶残留定性检测方法介绍5β-内酰胺酶残留定量检测可行性分析6优尔齐™i-TEST自动化检测系统β-内酰胺酶残留问题的由来1984198620092009•农业部办公厅下发《关于加强β-内酰胺酶等非食用物质监管的通知》农办牧(2009)11号。•卫生部公布《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》,其中β-内酰胺酶(解抗剂)明确定义为:非食品用物质。国家标准局发布了GB6914—86《生鲜牛乳收购标准》修订版增加了11项检测指标,其中明确规定β内酰胺类抗生素“不得”检出。2009年3月起,全国各地农业、卫生主管部门相继转发上述文件,相关行业对于违法添加β-内酰胺酶进行严控,各地监督、监察机构对β-内酰胺酶残留进行严格检测、监管。美国乳品科学协会第79届年会,威斯康辛大学研究人员报道了β-内酰胺酶分解牛奶中抗生素残留的研究。解抗剂的使用并认定是高效,简便的方法。β-内酰胺酶解抗剂的认识和管理过程β-内酰胺酶残留检测方法综述测定未分解底物(青霉素)的方法UV法羟肟酸测定法生物测定法(杯碟法)配体-受体法(SNAP、uni-sensor)测定底物分解产物的方法碘量法(青霉素裂解液中的青霉噻唑酸)pH测定法产色头孢菌素法β-内酰胺酶残留检测方法比较杯碟法具有灵敏、准确、直观的优点;作为确证方案,其操作略显繁琐、无法大规模筛选。底物测定法具有稳定、快速、高通量的优势,适用于大规模的样本筛选。碘量法的待测物(青霉噻唑酸)稳定、碘量法灵敏度高,是定量方法的首选。方法时间(分钟)检测限ppb/MRL检测成本定量方法杯碟法18~24小时4U/ml100¥-未分解底物测定法ReceptorbindingassaySNAP5+403/43.6€-ROSA8+402/43.5€-BetaStar3+603/43.4€-Twinsensor3+30¾3.5€-乳与乳制品β-内酰胺酶残留限量标准体外培养实验测算细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶,以此作为区分外源性与内源性β-内酰胺酶的理论依据。1个产超广谱β内酶胺酶(ESBL)菌株在生鲜牛乳体外培养过程中能够产生内源性β-内酰胺酶的活力(50~85U/ml)。对照组、实验组、添加组。兽医临床统计试验患病乳牛长期使用β-内酰胺类抗生素导致细菌产生耐药性;耐药菌自身能够诱导产生β-内酰胺酶;不同区域分布、不同品种乳牛、不同类型的抗生素使用之后内源性β-内酰胺酶的分布情况。统计分析计算内源性β-内酰胺酶在乳牛体内正常分布的数据。ESBL菌株体外培养实验对照组:肉汤培养;实验组:生鲜牛乳培养;添加组:不同浓度梯度青霉素添加培养。1个ESBL菌株种入30ml生鲜牛乳。4℃4000rpm,离心30min38℃24h重悬在5mlpH7.0的0.01MPBS去上清超声波破碎10s去上清4℃12,000rpm离心20min间隔5秒重复30次取上清液,-20℃保存备用兽医临床统计试验上海市科技兴农重点攻关项目:生鲜牛乳中非法添加物质“β-内酰胺酶”的检测技术研究上海畜牧饲料检测所;负责协调整个课题进度及微生物受体检测技术研究上海市乳品质量监督检验站;负责兽医临床样本收集及实际检测工作上海优你生物科技股份有限公司负责定量检测方法的研究项目进展兽医临床实验已进行30多例样本测试定量分析依据已生产碘量法-比色法β-内酰胺酶测定试剂盒,并申报企业标准Q/IRTI6-2009兽医临床统计试验临床统计设计要点:多中心临床——东北、华北、华东、华中、华南不同的地域分布;不同乳牛种群的影响因素:荷斯坦奶牛、黑白花奶牛等;不同类型的抗生素使用对细菌耐药性的影响:头孢菌素、青霉素等;兽医临床统计分析N=Zα2P(1-P)/δ2δ:允许误差P:灵敏度或特异度(灵敏度计算病例组样本量,特异度计算非病例组样本量)N区域样本组=(1.96)2×0.99×(1-0.99)/0.12≈4灵敏度99%;特异性99%;允许误差10%;显著性水平α=0.05时,Zα=1.96。每个区域样本量达到4例,即可满足统计学要求。临床试验的目的:内源性β-内酰胺酶在乳牛体内分布范围。兽医临床统计试验临床试验影响因素:停药期的定义和时间把控;生鲜牛乳冷藏保存β-内酰胺酶浓度是否会有变化;分光光度法定量测定生鲜牛乳及鲜乳本底值的影响;治疗过程中β-内酰胺类抗生素类别差异的影响;β-内酰胺酶残留定量检测可行性分析碘量法定量检测β-内酰胺酶的原理定量方法的选择终点法定量的结果分析速率法定量的结果分析青霉素荧光分光光度法定量结果分析三种分光光度法定量方法比较β-内酰胺酶TEM-1型结构碘量法定量检测β-内酰胺酶的原理碘量法是基于I2氧化性及I-的还原性所建立起来的氧化还原分析法。I3-+2e=3I-φI2/I-=0.545V碘量法中常用淀粉作为专属指示剂。作为一种特殊的指示剂,可溶性淀粉与游离碘生成深蓝色络和物的专属反应来指示滴定终点。当I2溶液的浓度为510-6mol/L时即能看到蓝色,极其灵敏。碘量法定量检测β-内酰胺酶的原理β-内酰胺酶分解青霉素的产物青霉素噻唑酸(benzylpenicilloicacid,BPA)可使碘-淀粉复合物褪色,通过测定吸光度值可定量检测β-内酰胺酶浓度。BPA是在强碱性或青霉素酶的作用下,引起β-内酰胺开环,生成的产物(1),而在其他条件下是一种含量极低的青霉素水解副产物。因此该方法相对添加固定量青霉素,经β-内酰胺酶反应后测定剩余青霉素含量的方法可降低假阳性。1赵静玫,都绛瑛,张铭俊.青霉素裂解液的高效液相色谱分析.色谱,2001,19(1):88~90碘量法滴定β-内酰胺酶的活性浓度β-内酰胺酶的活性单位定义为:在特定条件下(37℃),1分钟内转化1微摩尔底物(青霉素),或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量,称为一个国际单位(IU)。酶活力单位与青霉素单位的换算关系定量测定β-内酰胺酶的残留需要一把“尺”——衡量酶的活性浓度或质量浓度。测定β-内酰胺酶的活性浓度(IU/ml)的方法——碘量法滴定。根据《中国药典》(2005版)定义的β-内酰胺酶活力测定方案:37℃、60分钟内β-内酰胺酶转化底物(青霉素)成为青霉噻唑酸,青霉噻唑酸竞争与淀粉竞争结合I2。淀粉作为专属指示剂;硫代硫酸钠溶液为标准溶液;精确测定β-内酰胺酶的活性浓度。标定β-内酰胺酶的活力浓度I2•准确量取3mL反应液+0.01mol/L的碘25mL。•使用0.01000mol/LNa2S2O3作为标准液接近终点时加入淀粉:蓝→浅蓝→无色间接碘量法的典型反应避光放置β-内酰胺酶+青霉素青霉素噻唑酸I-酶稀释液10000U/mL青霉素+37℃反应1h取3mL反应液加入25mL0.01mol/L碘溶液避光15分钟用Na2S2O3滴定至接近终点加入淀粉指示剂溶液加入最后一滴Na2S2O3浅蓝色(无色)为终点β-内酰胺酶定量方法的选择小分子的蛋白(29kDa~39kDa)混在大量的蛋白溶液(牛奶)中;免疫分析法的特异性(β-内酰胺酶超过300种)局限;分光光度法线性范围及检测限的影响;生鲜牛乳中β-内酰胺酶的检测,目前可行的定量方法有微生物培养法及碘量法。0.0000.5001.0001.5002.0002.500051015系列1β-内酰胺酶高通量定量依据0~10U/ml拟合方程:y=5.0782xr=0.9994AC(U/ml)ΔA2.01100.0001.59820.4131.17840.8330.80361.2080.47081.5410.053101.9580.057121.9540.082141.9291.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品bCTIIAtlglg0未考虑吸收池和溶剂对光子的作用入射光I0透射光It入射光I0透射光It注意比较光电比色法测定β-内酰胺酶方案设计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器碘量法-比色法测定β-内酰胺酶的波长选择UV-2300紫外可见分光光度计全波长扫描显示:碘-淀粉溶液最大吸收峰为578nm;碘溶液最大吸收峰为351nm;01234300800AA01234300500AA酶促反应时间进程曲线•定量测定酶活性,必须找到不同酶反应速率和时间的关系;•确定酶促反应速率恒定的时间;•避开延滞期、非线性反应期。β-内酰胺酶Michaelis-Menten反应曲线DoubleReciprocalPlot0.01.02.03.04.05.0-0.2-0.10.00.10.20.30.40.51/[S]0(mM-1)1/V0(mM-1s)2xEtotal-Michaelis-Menten2xEtotal-AllostericKm(mM)=10RectangularHyperbolicPlot0.01.02.03.0010203040[S]0(mM)V0(mM/s)2xEtotal-Michaelis-Menten2xEtotal-AllostericKm(mM)=10DirectLinearPlot0.01.02.03.0-20-1001020304050[S]0(mM)V0(mM/s)-S8,V8-S6,V6-S4,V4-S2,V2-S1,V12xEtotal-Michaelis-MentenKm(mM)=10DirectLinearPlot0.01.02.03.0-20-1001020304050[S]0(mM)V0(mM/s)-S8,V8-S6,V6-S4,V4-S2,V2-S1,V12xEtotal-AllostericKm(mM)=10酶反应动力学定量方法比较速率法:每隔一定时间(2~60s),连续多次测定酶反应过程中产物量随时间变化的数据,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度。终点法:酶作用一段时间后,加入终止剂终止酶促反应,测定单位时间内产物生成量,计算酶促反应的平均速度。酶动力学法定量β-内酰胺酶酶活力的理论依据酶活性(IU/ml)=平均吸光度值/时间×因子(F)F因子=总体积×1000/样品量×t×e×s,其中:•t=测试时间(min)•e=摩尔消光系数•s=流通池光程(cm)C测=ΔA/min×F•ΔA/min指平均每分钟吸光度的变化值,F因子同上。荧光分光光度法定量测定底物青霉素的含量•芳香族化合物存在共轭的不饱和体系。青霉素就是典型的芳香族化合物,也是荧光分光光度法定量检测的依据。•产生荧光的有机物质,都含有共轭双键体系,共轭体系越大,离域大π键的电子越容易激发,荧光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52待测物试剂λexmaxλemmax测定范围ppm氨基酸氧化酶3154250.01~50蛋白质曙红丫紫外5400.06~6青霉素α-甲氧基-6-氯-9-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽4205000.0625~0.625不同的β-内酰胺酶定量分析方法比较杯碟法β-内酰胺酶方法学检出限为4U/mL(崔生辉,2007)。体外培养实验测定内源性β-内酰胺酶的活力浓度为**IU/mL。酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位(U)(activeunit)表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(IU)来表示酶的活力,规定为:在最适条件(25℃)下,每分钟内催化1微摩尔(μmol)底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位,即1IU=1μmol/min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示(U/g或U/ml)。定量方法β-内酰胺酶/青霉素活性浓度测定时间(min)回收率(%)CV%优点缺点速率法1~50U/mL190~1105速度快、结果准确、稳定、实现自动化操作全自动仪器价格较贵终点法3~15