产品管理--NEB产品知识和市场培训（PPT 51页）(1)

NEB产品知识和市场培训2001年8月市场与技术支持部第一部分NEB厂家背景回顾美国总部：Beverly,MA1975~2001支柱产品——工具酶先进的基因克隆和高表达体系的构建技术120种自主开发的酶60多种酶是由NEB首先筛选到并进入商品化生产二十五年的生产历史国际化的生产和营销网络在全世界35个国家和地区有分销商美国、英国、德国、加拿大四个生产基地专业水准的厂商发酵中心——生产部酶制备和DNA重组技术中心——研发部分子生物学和寄生虫学研究中心——基础研究院第二部分NEB产品讲解核酸工具酶DNA限制性内切酶DNA聚合酶、逆转录酶Vent系列的PCR聚合酶DNA/RNA修饰酶单位的定义在50l反应体系中，1小时内，完全消化1g的DNA所需要的酶量为1Unit包装与规格常用酶大多数为10U/l缓冲液4种不同颜色标记的标准缓冲液和特定缓冲液稀释液分为A、B、C三种，依表询储藏条件在不被稀释的情况下，可长期存放在零下20度长达20之久DNA限制性内切酶严格的质量检验：非特异性的内切酶活性检测核酸酶污染检测外切酶污染检测蓝白斑筛选检测DNA限制性内切酶针对于常用在克隆实验中的酶检验过量酶切对DNA末端的完整性是否有破坏NEB自主克隆的酶基因从重组菌株中提纯的酶随酶另附一管BSA酶识别位点被dam或dcm甲基化后不能被切动酶是否耐热经过蓝白斑法检测目录书中出现的标志符号的含义最佳的工具酶反应温度酶所对应的缓冲液编号DNA限制性内切酶Homing核酸内切酶识别12-40碱基的长的、对称识别位点的稀有内切酶同裂酶的概念识别同一酶切位点的一组内切酶BSA的作用酶保护剂，在反应中保证酶具有最佳的活性DNA限制性内切酶小常识：NEB限制性内切酶的卖点：种类非常齐全，（丰富的稀有酶）稳定性好，存放时间长价格在进口酶类里适中质量可靠DNA限制性内切酶DNA/RNA聚合酶DNA或RNA的探针标记3’末端和5’末端的补平3’末端的碱基置换DNA测序反应、定点突变和转录3’末端突出的切平特性：以单链DNA或RNA为模板，从5’端向3’端合成新链应用性能指标：•5’端向3’端的外切活性•3’端向5’端的外切活性•聚合速度•错配率•耐热性•延伸能力常用的种类：•E.coliDNAPolymeraseI•KlenowFragment（3’—5’exo-）•T4DNAPolymerase•TerminalTransferase•M-MuLVReverseTranscriptase•*M-MuLVReverseTranscriptase（RNaseH-）•T7/Sp6RNAPolymeraseDNA/RNA聚合酶NEBVent系列聚合酶特性/种类VentVent(exo-)DeepVentDeepVent(exo-)3'-5'外切活性有无有无5'-3'外切活性无无无无热稳定性95C6.7小时95C6.7小时95C23小时95C23小时错配率低较高最长扩增片段13.2kb15.0kb14.0kb15.0kbVentDNAPolymerase主要应用：常规PCR扩增双脱氧法测序NEBVent系列聚合酶VentDNAPolymerase与常规Taq酶的错配率比较卖点：高保真耐热性非常好DNA/RNA修饰酶DNA/RNAModifyingEnzyme连接酶…………………………Ligase激酶……………………………Kinase碱性磷酸酶……………………PhosphataseBeta琼脂糖酶…………………Agarase甲基化酶………………………Methylase核酸酶…………………………Nuclease外切酶…………………………Exonulease内切酶…………………………EndonuleaserecA重组蛋白酶………………recAProteinDNA/RNA修饰酶重点产品：T4DNALigase单位定义：20000NEBUnit=300WeissUnit4000NEBUnit=60WeissUnitT4PolynucleotideKinase（T4PNK）对DNA5’末端进行磷酸化，用于探针标记或克隆AlkalinePhosphatase,CalfIntesinal（CIP）去除DNA5‘和3’的磷酸基团，用于制备5‘的置换标记和载体克隆，阻止载体的自我连接。分子量标准DNA分子量标准常用类型：整数分子量的Marker1kbDNALadder2-logDNALadder100bpDNALadderNEW噬菌体DNA和质粒DNA酶消化型的DNA分子量标准非整数型的DNA分子量标准DNA分子量标准PGF分子量标准DNA被包埋在凝胶中，以注射器的形式包装用于几十kb至上千kb的DNA分离时的Marker脉冲电泳分离分子量种类：•LowRange•MidRange•LambdaLadder•YeastChromosomeRNA分子量标准适用于普通凝胶或变性胶条带为整数的分子量RNA分子量标准蛋白分子量标准蛋白分子量标准普通型…………2-212kDa（精确）预染型…………6-175kDa（估计）HRP蛋白Marker检测包6.5-165kDa（Biotin标记，BiotinAb）蛋白工具酶蛋白酶内切糖苷酶外切糖苷酶蛋白激酶和抑制剂蛋白磷酸化酶和抑制剂FactorXaProtease探针标记杂交检测NEBlotKit随机引物法探针标记试剂盒下游应用：•文库筛选•Southern/Northern•原位杂交卖点：标记的dNTP参入率高模板用量在25ng到2ug半小时即可完成标记反应可用于多种类型的标记dNTP（同位素或非同位素标记）NEBlotPhototopeKit随机引物法生物素探针标记试剂盒用于化学发光检测与Phptotope-StarChemiluminescentDetectionKit配合使用生物素标记的探针稳定，可长时间存放杂交后可洗脱下来，进行反复杂交Phptotope-StarChemiluminescentDetectionKit卖点：灵敏度同位素检测法相当曝光时间短，只需10-70分钟信号稳定，可通过改变曝光时间来摸索最佳的信号强度第三部分NEB蛋白表达产品介绍1.pMAL蛋白融合表达与纯化系统卖点：生产级别的应用高水平表达量－1升培养上清可达到100mg的蛋白产量与MBP融合表达可以增加蛋白的溶解性1.IMPACT蛋白表达与纯化系统卖点：应用了蛋白内含肽自我剪切技术无需蛋白酶去除标签，只需一次过柱纯化过程Intein可接在蛋白的C端或N端IMPACT-CNSystemIMPACT-TWINSystem卖点：应用了蛋白内含肽自我剪切技术，将两个Intein接在目的蛋白的两端。无需蛋白酶去除标签，只需一次过柱纯化过程Intein行使剪切功能后，可在目的蛋白两端产生带S的氨基和羧基，可环化，可标记第三部分NEB英文目录附录的内容介绍NEBcutterV1.0内容一分子生物学数据库索引REBASE限制性内切酶数据库3100种限制性酶的相关信息酶的基因序列、甲基化敏感位点、结构……5600篇参考文献InBase内含肽数据库分子生物学数据库网址总汇224个网址可按功能领域分类查找内容二工具酶常用查询表以酶识别序列分类的索引同裂酶索引限制性内切酶的发展历史和知识背景NEBuffer的酶－活性对照表双酶切缓冲液选择表酶－稀释液对照查询表限制性酶在引物延伸反应中的活性表限制性核酸内切酶的热失活对照表酶切反应酶用量查询表补平反应新酶识别位点查询表相同粘端酶查询表限制性酶识别位点中甲基化位点查询表内容三分子生物学常用工具表常用E.coli菌株表型及基因型查询表常用遗传标记NEB菌株描述遗传密码表氨基酸化学结构常用单位换算常用载体上的酶识别位点出现频率常用载体的酶切图谱内容四分子生物学实验Protocol琼脂糖包埋的DNA的限制性酶消化基因组酶消化的选择指导甲基化酶反应第五部分NEB销售统计分析2000年度NEB全国销售额的大区分配4.8513.085.56北京区上海区广州区单位：万美金12345678910QIAGENClontechNEB分子生物学试剂产品销售比例统计2000.4~2001.3NEB产品种类销售比较12%60%9%8%6%3%2%XSEnzymeRestrictionEnzymeModifyingEnzymeDNAMarkerProteinMarkerProteinExpressionOthers2000.4~2001.32001.4~2001.7NEB产品种类销售统计7%62%12%7%7%5%0%XSEnzymeRestrictionEnzymeModifyingEnzymeDNAMarkerProteinMarkerProteinExpressionOthers今年与去年4月至7月同期销售额比较785770564997809113402157471521813454020000AprilMayJuneJuly20002001比去年同期增长一倍多NEB2000年度月销售统计0.0010,000.0020,000.0030,000.0040,000.00April-00June-00August-00October-00December-00February-01NEBNEB2000年度上海地区销售统计1431301.82101065.54120128.9869642.110500000100000015000002000000上海江苏浙江湖北年销售额0100200300XSSM+LTotalHincⅡSphⅠT4PNKSpeⅠT4DNAPolymeraseEcoRⅤKlenowSmaⅠPstⅠSacⅠBglⅡNocⅠXbaⅠSalⅠHindⅢXhoⅠEcoRⅠBamHⅠNotⅠT4Ligase目前的小酶库存ECORIHincIIHindIIIMspIHaeIIINdeISnaBIBamHISALIPSTISMAIKpnIBGIIIXBAIXHOIPvuIISacIBstEIISAU3AIFNU4HISphISTUINotINcoIECORVClaIPNKT4DNALigaseT4DNAPolymeraseKlenowMungBeanNucleaseM-MuLV-ReverseTranscrVentVent(exo-)DeepVentCIPMseIMscINSPI目前的小酶库存ECORIHincIIHindIIIMspIHaeIIINdeISnaBIBamHISALIPSTISMAIKpnIBGIIIXBAIXHOIPvuIISacIBstEIISAU3AIFNU4HISphISTUINotINcoIECORVClaIPNKT4DNALigaseT4DNAPolymeraseKlenowMungBeanNucleaseM-MuLV-ReverseTranscrVentVent(exo-)DeepVentCIPMseIMscINSPITakaraLTI(Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI华美国内竞争对手市场价格比较工具酶价格比较0.000.501.00T4LigaseNotⅠBamHⅠEcoRⅠXhoⅠHindⅢSalⅠXbaⅠLTIRocheMBITakaraPromegaNEB0.000.200.400.600.801.001.201.401.60PstⅠKlenowEcoRⅤSmaⅠT4DNAPolymeraseSpeⅠT4PNKSphⅠHincⅡNEB0.630.310.31Promega2.250.410.39Takara0.440.220.22MBI0.550.220.21Roche3.811.020.65LTI2.890.81——