骨碱性磷酸酶检测试剂盒(酶联免疫法)说明书

骨碱性磷酸酶检测试剂盒（酶联免疫法）说明书【产品名称】通用名称：骨碱性磷酸酶检测试剂盒（酶联免疫法）英文名称：OSTASE®BAPEIA【包装规格】96人份/盒【预期用途】骨碱性磷酸酶检测试剂盒（酶联免疫法）仅用于体外诊断使用，用于定量检测人血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）。作为成骨细胞活性的指示剂，本试剂盒可作为管理绝经后骨质疏松和变形性骨炎的辅助工具。骨是一个动态的组织，人的一生始终贯穿着骨的生成和骨的溶解（也叫骨吸收），这个过程称之为骨重建。骨重建过程是在两种骨细胞交互作用完成的复杂过程：成骨细胞影响骨的生成，而破骨细胞影响骨的吸收（1-3）。骨形成和骨吸收是一个在正常环境下紧密耦联的相互依赖的过程（2，4）。这种耦联关系是保持骨骼生化活性不可或缺的部分，从而维持了骨组织的结构、外型及强度（2，3，5）。血清骨碱性磷酸酶（BAP）的水平被认为反映了成骨细胞的代谢状态（6，7）。骨代谢的精确评定对于测定骨代谢疾病的严重程度和治疗疗效起着关键性的作用。血清BAP水平的测定已显示有助于评估变形性骨炎、骨软化症、原发性甲状旁腺功能亢进、肾性骨营养不良、骨质疏松症和骨转移患者（6-10）。总碱性磷酸酶测定已被认可应用于变形性骨炎的诊断和病人的监测。变形性骨炎是一种常见的骨骼紊乱，表现为正常骨细胞的局灶性增生。变形性骨炎的发病率比曾一度认为发病人群在3%-4%的中年患者和10%-15%的老年人要高出许多。这种疾病不影响年轻人。绝大部分变形性骨炎患者无临床症状，容易漏诊，除非在一些不相关原因的医疗检查时出现X摄片或血清碱性磷酸酶水平异常时才发现的。这种症状的患者昀常见的症状是疼痛和畸形。骨质疏松症风险（另一种骨重建紊乱），部分取决于骨骼发育，达到骨量峰值后，生命机体晚期出现骨量丢失。在正常儿童中，骨形成速度快于骨吸收，因此出现骨的发育及正常骨骼生长（3）。在健康年轻成人中，骨吸收与骨形成相互平衡，出现骨量既无增长也无降低。随着年龄的增加，男性和女性经历骨重建的不平衡，其反应是骨吸收开始轻度大于骨形成，这就造成了骨量随着时间的变迁出现持续丢失（1，2，4，12）。如果这种不平衡持续，骨量可能下降，直到骨组织不能维持其正常的机械强度，从而逐渐不正常并易于发生骨折（5）。骨量过度丢失及骨折的易感性增加则导致紊乱，出现骨质疏松症。骨质疏松症昀常见于绝经后妇女，在于雌激素水平不足（2，12，13）。在停经和双侧卵巢切除后，雌激素水平下降，出现骨量的快速丢失。快速的骨量丢失是由于骨重建的不平衡和骨转换增强的联合作用造成的结果（5，14-16）。在美国，骨质疏松症影响着约2500万绝经后妇女，以及由此造成的每年150万人次的骨折，包括近50万人次的脊椎压缩性骨折，25万人次的髋部骨折和20万人次的桡骨远端骨折（2，5，17）。雌激素替代疗法被认为是目前能预防绝经后妇女骨质疏松性骨折而被广范应用（4，5，18-20）。然而，许多女性不能或不愿采用这种激素替代疗法，原因在于其提升了肿瘤风险及恢复月经。基于这个原因，其他化合物如双膦酸盐（一种治疗变形性骨炎的标准治疗用药）已开发用于治疗骨质疏松症。双膦酸盐的抗骨吸收特性削弱了骨的重建，从而减少了骨量的全面丢失。生化标志物有助于监测骨代谢疾病。尿羟基脯氨酸和血清总碱性磷酸酶水平已用于监测变形性骨炎治疗疗效。骨质疏松，表现为一种更轻微的骨重建过程的修正，因此需要更为特异和灵敏的标志物。骨碱性磷酸酶检测试剂盒是一种用于定量测定人血清中骨特异性碱性磷酸酶水平的体外诊断试剂。BAP水平的变化已显示对那些正经历骨代谢紊乱治疗的病人有用（6，7，10，21，22）。【检验原理】本试剂盒是一种固相单克隆抗体酶联免疫测定。样本中的BAP与含有生物素标记的BAP特异性单克隆抗体的溶液进行反应。反应发生在包被了链霉亲和素的微孔中（微孔固定于塑料板框中），形成固相/捕获抗体/BAP复合物。微孔洗涤除去未结合的BAP，再加入酶底物进行孵育。终止反应后，在酶标仪405nm下读取吸光度。吸光度值与待测样本中BAP浓度成正比。样本中BAP浓度的计算基于BAP标准品及标准品0/稀释液的同步检测。【主要组成成份】1.结合物：含抗BAP抗体（小鼠单克隆IgG）-生物素、叠氮化钠（0.09%）的牛/马蛋白基质。每瓶14mL。2.微孔板：板孔内包被链霉亲和素，包装于带干燥剂的铝箔袋中。12×8孔3.标准品0/稀释液（0）：不含BAP的牛蛋白基质，含叠氮化钠（0.09%）。每瓶14mL。4.标准品（1-5）：含BAP、叠氮化钠（0.09%）的牛蛋白基质，BAP浓度分别为7，15，30，60，90（μg/L）。每盒5瓶，每瓶1mL。5.低值质控品（1）：，含BAP（约11μg/L）和叠氮化钠（0.09%）的牛蛋白基质，指定范围请参考质控报告单。每瓶1mL。6.高值质控品（2）：含BAP（约45μg/L）和叠氮化钠（0.09%）的牛蛋白基质，指定范围请参考质控报告单。每瓶1mL。7.浓缩洗液（20×）：含吐温的磷酸盐缓冲液。每瓶50mL。8.底物：含对硝基苯磷酸盐（pNPP）、防腐剂的稳定缓冲液。每瓶20mL。9.终止液：含1N氢氧化钠。每瓶14mL。10.质控报告单，说明书：各1份【储存条件及有效期】试剂盒须置于2～8℃保存，效期为12个月（自生产之日起计）。试剂盒可稳定至包装上所示的昀后日期。洗液和终止液在2-30℃下保存至有效期截止日；所有试剂在使用前应平衡至室温（18-25℃）；未用完的试剂（除洗液）应置于2-8℃下保存；试剂盒质控品浓度的回收率应落在指定范围内；未用完的微孔板条应放回附有干燥剂的铝泊袋，置于2-8℃下保存；请勿使用失效的试剂。【适用仪器】适用于配备405nm和650nm滤光片的酶标仪。【样本要求】病人无需特别准备。全血样本应通过可接受的医学技术采集。允许血液凝结，通过离心分离出血清。采用血清样本，尚未确立血浆样本可操作性。血清样本于2-8℃下可保存24-48小时。长期保存（不超过39个月）时须置于-80℃下保存。混浊血清样本或样本出现颗粒物，应离心后检测。【检验方法】1．自备试剂和材料可调式移液器：固定量或可调式（50，100和150µL）（±1%）。多通道移液器可采用一次性V形槽来移取抗BAP结合物、底物和终止液。一次性吸头（50，100和150µL）试管（用于样本稀释）洗板机振荡器蒸馏水计时器洗液储存容器（如洗瓶）酶标仪（配备405nm、600-650nm滤光片）及数据分析软件水平微孔振荡器（频率500-900rpm）若需完整试剂处理系统，数据处理系统及液体处理装置，请与您当地的经销商联系。2．试剂准备所有试剂在使用前平衡至室温（18-25℃）。使用前轻轻摇晃或上下颠倒混刀试剂。每个样本、标准品、质控品均采用一次性吸头以避免污染。洗液：将浓缩洗液与950mL蒸馏水混和均刀。3.操作过程实验前，确保试剂盒在室温下（18-25℃）操作。使用前将所有血清样本及试剂盒组分恢复至室温并混刀。标准品0/稀释液、标准品及质控品需在同一块板上双孔侧定。因为每一次孵育的终止会终止该反应的进程（如抗体结合或底物周转），测定的可靠校准取决于确保孵育次数对所有孔来说都是同样的（至关重要）。操作步骤如下：3.1打开铝泊袋，取出所需数量的微孔板条置于板框内。每次测定时6个标准品、低值质控和高值质控应双孔测定。3.2在相应孔中加入50µl标准品0、标准品（1-5）、质控品和病人样本。3.3每孔加入100µl结合物。3.4室温（18-25℃）下采用水平振荡器（500-900rpm）孵育1小时。3.5洗板3次a)从第一板条起吸出液体；b)每孔注入300µl洗液c)接下来重复a)和b)步骤d)重复1)和c)步骤两次。3.6每孔加入150µl底物液。进入下一步前无停顿。3.7室温（18-25℃）下振荡（500-900rpm）孵育13-15分钟。3.8每孔加入100µl终止液。3.9在酶标仪上测量吸光度（主波长405nm，次波长600-650nm）。应在加入终止液后1小时内读板。3.10计算结果（见“检验结果的解释”部分）。注意事项：1）洗板时应注意：酶联免疫检测试剂要求有效洗板以去除未结合的生物素标记抗体。因此，有效清洗每孔是非常重要的，应去除昀后一滴洗液以获得昀佳结果。2）如果样本发现包含BAP浓度高于昀高标准品值，则采用标准品0/稀释液稀释样本后再根据试剂盒操作程序进行测定。稀释因子应结合入结果计算当中。检测前每一稀释样本应完全混合均刀。包含BAP浓度高于昀高标准品值时的样本推荐稀释比例为1：3，1：5或1：10。然而，包含BAP浓度高于昀高标准品值时的样本须稀释，使得稀释后的样本读取结果将高于10µgBAP/L.3)由于吸光度受温度和底物孵育持续时间影响，因此要求每孔/板孵育相同是非常重要的，这须确保从头至尾移取液体的时间是一致的，不得有中断，底物及终止液加入时须完全相同。为确保昀佳结果，这些试剂的加样须不超过90秒并且总底物孵育时间不得超过15分钟。4）方便起见，多道移液器或可重复移液器可用于分发测定结合物、洗液、底物和终止液。推荐采用配有一次性吸头的移液器来移取标准品、质控品和样本。每一样本移取时吸头须更换以避免样本或试剂出现污染。5）不要混用不同批号的试剂盒的材料。【参考值（参考范围）】本试剂盒的参考范围是依据Tandem-ROstase检测试剂盒测定得出，然而，相关性研究表明，本试剂盒与Tandem-ROstase检测试剂盒的一致性良好（y=1.02x+0.28，r=0.9700，n=136）。采用Tandem-ROstase检测试剂盒在6个场所对健康成人（20-89岁）进行测定。下表中分别提供了男性（N=217）、绝经前女性（N=228）和绝经后女性（N=529）的BAP浓度均值、标准差（SD）、中值和第95百分位值。健康成人BAP浓度(μg/L)总结*例数BAP均值(μg/L)SDBAP中值第95百分位值男性21712.34.311.620.1绝经前女性2288.72.98.514.3绝经后女性52913.24.712.522.4*结果来源于Tandem-ROstase放射免疫测定试剂盒上表显示，绝经后女性的BAP浓度均值明显高于绝经前女性（P≤0.0001），BAP浓度均值的升高反映了绝经后妇女骨重建增强，这与绝经后妇女相比绝经前妇女雌激素不足有关（2,8,12,13）。然而，正如下面分布图所示，人群间BAP浓度有相当大的重叠部分。健康成人中BAP浓度的分布Pre-M=绝经前Post-M=绝经后*采用Tandem-ROstase放射免疫测定生成结果每一类人群均显示出：1）每个箱盒的水平线代表浓度中值；2）每一箱盒的上层和下层边缘代表四分位数间距，如上层边缘定界25%的值高于中值，而低层边缘定界25%的值低于中值；3）每一低线距的顶端代表第5百分位的浓度，而每一高线距的顶端代表第95百分位的浓度。上述报告所观测的范围仅代表本次研究，无必要在另一项个体临床实验室观察时显示这个范围。每个实验室应建立自己的参考范围。【检验结果的解释】1.结果计算采用数据处理软件或在线形坐标纸上手工计算结果。1.1计算机辅助计算建议采用点对点折线拟合。以各标准品（0-5）的吸光度均值对其BAP浓度描点，各点之间以直线连结绘制成标准曲线。1.2手工计算在线性坐标纸上，以各标准品的吸光度均值为纵坐标，BAP浓度为横坐标，描出各标准品点，各点之间以直线连结绘制成标准曲线。不要强行将曲线描为直线。计算质控品和样本BAP浓度时，根据样本吸光度从纵坐标相应位置作一条水平线与标准曲线相交，经过交点再作一条垂直线与横坐标相交，在交点处读取样本BAP浓度。如果样本吸光度大于昀高浓度标准品吸光度，应稀释后重新检测，计算结果时应将读取浓度乘以稀释倍数。如果任何样本吸光度值大于昀高标准品的吸光度值，则样本须进行稀释并重新进行测定。稀释后的样本所测浓度须乘以稀释因子。数据举例：孔号描述吸光度吸光度均值BAPμg/L10.1932标