肿瘤侵袭转移实验技术

肿瘤侵袭、转移实验技术首都医科大学2015.11目录一、概述二、细胞划痕实验三、Transwell四、裸鼠尾静脉注射实验五、总结一、概述肿瘤侵袭和转移体外体内细胞划痕实验Transwell裸鼠尾静脉注射二、细胞划痕实验细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。实验优点：1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。2.适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。二、细胞划痕实验实验材料：细胞样品仪器、耗材：6孔板marker笔直尺枪头试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS二、细胞划痕实验1.所有能灭菌的器械都要灭菌2.超净工作台紫外线消毒30min注：需要灭菌的器材包括——离心管、吸管筒、移液枪、枪头等二、细胞划痕实验4.每孔加入5X105个细胞并培养约24h注：1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整2.数量少时可培养一段时间至铺满板底（3.6孔板背面画线5-6条）二、细胞划痕实验5.用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致注：.人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷二、细胞划痕实验6.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞二、细胞划痕实验7.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，（6），12，24小时取样，拍照。8.计算、比较、分析①imageJ软件计算每个视野的划痕面积②二、细胞划痕实验新：德国IBIDI（易必迪）技术1.准备细胞，培养液，cultureInsert。2.将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。3.细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。4.每隔4-6小时拍照记录。5.根据收集图片数据分析实验结果二、细胞划痕实验谈几点问题：1.细胞的选择：一般适用于上皮，纤维样细胞系a.本身有迁移能力，且较强。b.有极性，方便测量，观察。c.对无血清有较强的忍受力。2.观察的时间：一般为0、6、12、24ha.时间太久，无血清，易死亡，相对坚强b.时间太久，细胞繁殖，假阳性二、细胞划痕实验三、TranswellTranswell是一种应用Transwell小室来探究细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等的问题的实验技术。三、Transwell①Transwell小室：常用8.0um膜，铺胶130rmb、不铺胶40rmb，可重复利用②上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2%BSA③细胞：有侵袭能力细胞先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验材料准备及说明：三、Transwell④基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel⑤下层培养液：含5%－10%FBS的培养基，也可用趋化因子⑥细胞培养板：6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用材料准备及说明：三、Transwell1.Transwell小室制备①包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。三、Transwell2.取细胞悬液加入Transwell小室，24孔板小室一般200µl。细胞密度为1－10×105个.3.24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基。三、细胞划痕实验4.培养细胞：常规培养48h，具体调整5.结果测定：①直接测定：细胞染色，镜下计数②间接测定：MTT法、荧光试剂检测、结晶紫染色问：某药可抑细胞侵袭，24h后可抑制细胞增殖，可以培养36h看结果吗？三、Transwell直接观察：①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞②染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。③细胞计数：把小室反过来直接观察或把膜切下直接染色，取若干个视野计数细胞个数问：①、②先后问题？三、Transwell间接观察：结晶紫法①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞②染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。③染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映细胞数。四、裸鼠尾巴静脉注射小鼠肿瘤转移模型分类：1.人工转移模型：将肿瘤细胞体外培养株或腹水等行注射，在肺(尾静脉注射)、脑(颈动脉注射）肝脏(肝动脉注射）等部位观察2.自发转移模型：肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原组织中，观察转移灶。四、裸鼠尾巴静脉注射1.裸鼠的选择：4-6周裸鼠、价格约100+rmb2.细胞的选择：查阅文献，选择合适细胞株；细胞浓度：具体不定，动物肿瘤一般接种2～600万/只就100%成瘤，而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤四、裸鼠尾巴静脉注射3.注射技巧：①固定：50ml离心管自制或购买成品②注射位置：鼠尾部侧面的2条静脉，一般在尾部远端的1/3到1/2处进针。③注射：选择1-2ml注射器，针头采用4号或4.5号。④凸显静脉：温水，烤灯等四、裸鼠尾巴静脉注射问：如何判断已经注射进入：注射到静脉的推液几乎没有阻力，可快速将液体推完通常600ul可在10秒推完。如果注射到静脉以外，强行推液，阻力较大，注射处周围会出现露水样渗液，而且出针后，出血较少。并且由于药液瘀阻在尾部，导致血流不畅，尾部缺血，易导致尾部炎症和坏死。四、裸鼠尾巴静脉注射4.观察结果：①影像；②大体解剖测量；③组织切片染色如何算一个完整的实验？五、总结细胞划痕实验transwell裸鼠尾静脉注射谢谢！首都医科大学2015.11