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酶的固定化技术、现状及其发展趋势摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术)及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。酶的固定化(Immobilizationofenzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。下面从传统固定化技术、传统固定化技术的改进、新型固定化技术等三个方面来概述一下酶固定化方法的研究进展：一、传统固定化技术⒈吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法。吸附法包括物理吸附和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点,可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料,有时酶的纯化与固定化也可同时实现。因酶分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性,共价结合法是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。物理吸附法常用的吸附剂有活性炭.氧化铝.硅藻土.多孔陶瓷.多孔玻璃.硅胶.羟基磷灰石等。吸附法制备固定化酶,操作简便,条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价廉易得,而且可反复使用。但酶与载体的结合不牢易于脱落,所以它的使用受到一定的限制。但是,吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键固定的酶易受反应介质的pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。⒉包埋法将酶或酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊型两类,其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。包埋法专用的载体主要有:明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。包埋法根据载体材料和方法的不同,可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。但是,包埋法中高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择性不利于大分子底物与产物的扩散。⒊结合法选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起而制成固定化酶的方法,称为结合法。根据酶与载体结合的化学键的不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法通用的载体是各种离子交换剂,用离子键结合法制备的固定化酶,操作简便,活力损失少,但是结合不牢固,在pH值和离子强度等条件变化时,酶容易脱落。共价键结合法常用的载体有:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。用共价结合法制备的固定化酶,结合牢固,酶不易脱落,可连续使用相当长的时间。但载体的活化操作比较复杂,因为结合法有较激烈的反应而使酶活力损失较大。结合法制备固定化酶所用的高分子载体带有强的反应基团,如重氮盐、醛、酰氯、活性酯等活性基团,以保证酶的固化过程得以在比较温和的条件下进行。常用的载体有重氮化聚苯乙烯、缩醛类聚合物、聚酰胺等。近年来,固定化酶的载体研究发展很快,已产生几大类别的载体。可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体。在有机高分子载体中,天然高分子凝胶载体一般无毒性,传质性能好,但存在强度较低、在厌氧条件下容易被细菌分解和寿命短等问题。常见的有琼脂,海藻酸钠,明胶等。近年来新兴起的新载体是甲壳素和壳聚糖。而合成高分子凝胶载体一般强度较大,但传质性能较差,会对酶的活性产生影响。常见的载体有聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等。近年来,人们又合成出许多具有优良性能的新载体,如:聚乙烯醇冷冻胶,聚乙烯醇氧化物,无孔聚苯乙烯/聚苯乙烯磺酸钠PS/PNaSS微球载体,PF凝胶载体(对苯二酚和甲醛聚合物),球状纤维素单宁树脂,多孔醋酸纤维素球形载体等。以无机材料为固定化酶载体具有一些有机材料不具备的特点,如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物分解等特性。在这方面,美国的UOP公司以氧化铝为载体,德国的Milss公司以二氧化硅为载体制备固定化酶取得了显著的成效。复合载体材料是将有机材料和无机材料复合组成,以改进材料的性能。磁性高分子微球是近年来研究的较多的一类复合载体材料。⒋交联法借助功能试剂使酶分子之间发生交联作用而制成固定化酶的方法,称为交联法。交联法亦称架桥法,游离酶的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化可得酶蛋白单位浓度较高的固定化酶。常用的双功能试剂有戊二醛.己二胺.顺丁烯二酸酐.双偶氮苯等,其中应用最广泛的是戊二醛。用交联法制备的固定化酶结合牢固,可长时间使用。但是,由于交联反应较激烈,酶活力损失较大。实际使用时,往往与其他固定化方法联合使用,如将酶先经凝胶包埋后,再经交联等。这种采用两种或多种方法进行固定化的技术,称为双重或多重固定化法,用此法制备的固定化酶活性高,机械强度好。⒌热处理法将含酶细胞在一定的温度下加热一段时间,使酶固定在菌体内的方法,称为热固定化法。热固定化法只适合于那些热稳定性较好的酶。在加热处理时,一定要掌握好加热温度和时间,以免引起酶的变性失活。诚然,前述各种酶固定化方法有各自的优点和不足,但固定化酶也存在着一些共同的缺点：①对于一些可作用于大分子底物,也可作用于小分子底物的酶而言,经固定化后,由于受到载体空间位阻作用的影响,大分子底物难于接近酶分子,从而使其催化反应速度大大降低,而小分子底物的反应速度则不受影响;②酶固定化的过程中,失活的酶量较大;③载体的带电性质对固定化酶的最适pH值有明显的影响:一般来说,带负电的载体制备的固定化酶,其最适pH值比游离态的高;带正电的比游离态的低;电中性的不变化。以上是在制备和应用固定化酶的时候应该特别注意的。这些不足之处限制了固定化酶的广泛应用,成为亟待解决的主要问题。因此,开发简便、温和、适用的固定化方法,设计合成性能优异且可控的载体,以及应用工艺的优化研究等使固定化酶及其酶促反应的研究至今方兴未艾,仍是目前研究热点之一。二、传统固定化技术的改进保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。将酶吸附于离子交换树脂上后,再用多官能基化合物交联可提高固定化胰蛋白酶的活性及稳定性。在有硫酸铵或水溶性聚乙二醇存在时,会大幅度提高疏水性载体对酶的吸附率;在底物反应液中加入维生素C时,可提高固定化葡萄糖氧化酶的使用性能;调节pH值,则能使酶固定化及固定化酶处于一个最佳的微环境中。戊二醛类双官能团偶联剂的一端保护后活化载体,再脱保护并固定化酶时可大幅度提高酶活力的回收率。这些研究结果表明,通过改进传统固定化方法而改善固定化酶的性能是可行的。载体的结构与性能研究是传统固定化技术改进的重要方面。考虑到生物大分子酶及某些大分子底物与产物的传质和扩散的需要,李彦锋等采用线型聚合物致孔法合成了球状特大孔丙烯腈与醋酸乙烯酯的共聚物(MR-AV树脂),再转化为聚丙烯酰胺肟-聚乙烯醇载体固定化嗜热菌蛋白酶。结果表明,固定化酶活性随载体孔径的增大而提高;MR-AV树脂与含水乙二胺反应生成聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯醇载体时亲水性进一步增强,其固定化前列腺素合成酶及木瓜蛋白酶时皆可获得良好结果。增加载体活性侧基的空间悬臂(Spacer)的长度有利于减少空间阻碍而提高载酶量及固定化酶活性,如用不同链长的二元胺活化聚丙烯酸甲酯及聚氯乙烯大孔球状载体时,固定化酶的活力则随活化侧基链长的增加而提高。膜载体具有组装连续运转生物反应器的优势,如β-半乳糖甙酶被聚甲基丙烯酸羟乙酯膜固定化后,可高效催化乳糖水解且连续运行30h的酶量损失10%,显示出良好的操作稳定性。琼脂糖制成珠状并固定化胰蛋白酶、糜蛋白酶后可高产率地从牛肺提取液中制备高比活力抑肽酶,甲基苯磺酰活化的粉状琼脂糖及玉米蕊载体固定化脂肪酶时其酶促活性及稳定性得到显著改善。废蚕丝经功能化处理后固定化脂肪酶的活力回收52%、操作半衰期达到250h,球形交联状壳聚糖固定化α-淀粉酶的比活力达820U/g、具有良好的稳定性。Tiller等用对苯二胺活化甲基苯磺酸纤维素酯制备的超分子结构载体在固定化葡萄糖氧化酶、过氧化物酶及乳酸酯氧化酶时,固定化酶的比活力可高达660U/g、且具有良好的稳定性及分析应答性。天然载体既具有适宜的生物相容性及亲水性,又多为可再生资源,故应予以足够重视。壳聚糖也已被广泛应用于固定化酶的研究,姜梅等研究了以壳聚糖膜为载体、戊二醛为交联剂的固定化葡萄糖氧化酶的特性。结果表明:固定化酶的Km值为12116mmol/L,溶液酶的Km值为20186mmol/L固定化酶比溶液酶更耐热,且贮藏稳定性及操作稳定性也有所提高;固定化酶重复使用率较高。三、新型固定化技术运用当代高新技术设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。利用超声波使高分子主链均裂产生自由引发功能性单体,再聚合成嵌段共聚物载体固定化酶的结果表明,借助现代技术可使一般性聚合物经功能化改性成为新的酶固定化载体。1.磁性载体磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物一起溶解混合后,再除去溶剂可获得磁性载体,其固定化葡萄糖氧化酶在适宜条件下的酶活力回收可高达70%。磁性载体固定化酶由于Fe3O4的磁响应性从而能借助外部磁场简便地回收,已引起人们的极大研究兴趣。其中,磁性高分子微球是近二十年来发展起来的一种新型功能高分子材料。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物)的超细粉末,而具有磁响应性的高分子微球。近年来,磁性高分子微球也用于固定化酶的研究。与非磁性材料相比,磁性高分子微球作为固定化酶的载体具有以下优点:①.有利于固定化酶从反应体系中分离和回收,操作简便,对于双酶反应体系,当一种酶的失活较快时,就可以用磁性材料来固载另一种酶,回收后反复使用,降低成本;②.磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中,可以减少持续反应体系中的操作,适合于大规模连续化操作;③.利利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向,替代传统的机械搅拌方式,提高固定化酶的催化效率。磁性高分子微球的合成方法主要有:①.利用天然高分子材料包埋磁性微粒,可以得到纳米级的磁性微球;②.在磁流体的存在下进行聚合反应,得到微米级的磁性微球。Munkd制备了纤维素等三种磁性高分了微球,用于凝乳化蛋白酶的固定化,研究了不同壳层、不同磁核及粒径对酶的活性及固定量的影响;Iman将PS/Fe3O4微球用于尿素酶的固定化;邱广亮等采用乳化复合技术制得磁性淀粉复合微球,并以此微球为载体,采用溴化氰共价结合法、戊二