色谱分析法

第六章色谱分析法内容TLCGCHPLC第一节薄层色谱法定性常作为监测手段定量薄层扫描制备薄层色谱制备代谢产物常用第二节气相色谱法优点：具有分离和分析两种功能，选择性好、灵敏度高、用样量少、分析速度快和应用范围广。适用：生物样品中具有一定挥发性和热稳定性的药物及其代谢物的分离测定。（可衍生化）一、概述二、仪器简介载气进样器色谱柱检测器记录装置1.载气（流动相）：常用高纯氮，其他：氦气、氢气、氩气。2.进样：1）气体进样、液体进样2）进样室温度一般等于或高于柱温，以便注入的样品能瞬间挥发。3.色谱柱：由柱管和管内的固定相组成。柱管材料通常用不锈钢或玻璃组成。生物样品分析中通常采用玻璃柱。原因：（1）近于惰性，不会引起被测组分热催化分解。（2）还可先经硅烷化处理后再装填固定相，能降低管壁对药物的吸附。常用一般填充柱和毛细管柱两类。毛细管柱又分为填充毛细管柱和开口毛细管柱。4.常用检测器（1）氢火焰离子化检测器：（hydrogenflameionizationdetector,FID）体内药物分析中应用最广泛，凡是能在氢-空气火焰中电离的有机药物及其代谢物都能被检测出来，而无机药物与惰性气体对该检测器均不产生电信号。（2）氮-磷检测器(nitrogenphosphorusdetector,NPD)碱焰离子化检测器(AFID)对氮和磷敏感。（3）电子捕获检测器(electroncapturedetecor,ECD)是一种有选择性的高灵敏度的检测器。主要用于测定含有卤素或含有-CONH2、-CN、-ONO、-NO2等吸电子基因的有机药物。（4）质谱检测器(massspectrometrydetector,MSD)用于气相色谱-质谱联用技术。三、定量分析方法系统适用性试验理论板数，分离度，重复性，拖尾因子内标法外标法四、顶空分析法生物样品一般不能直接用GC法分析，原因：1、水分的影响。2、大多内源性成分挥发性很低，沉结柱头，损坏色谱柱。因此一般需萃取，纯化后进样。少数情况下，被测组分挥发性强，可用顶空分析法。顶空分析法：（又称液上气相色谱分析法）不经过萃取直接分析的方法生物样品中仅用于测定挥发性强或低沸点的药物，如血中的醇、醛以及某些麻醉气体，或一些挥发性强的内源性成分。如：尿中的三甲胺。必要条件：被测组分在测定温度下有足够高的蒸气压例：血中乙醇浓度测定内标方法：样品（血液）和内标（丙醇）加入样品瓶，60℃水浴30min后，用注射器直接抽取瓶内液面上的气体5ml，迅速注入气相色谱仪，进行色谱分析。由于直接测定的是与液体样品平衡的气体，因此，又称为液上气相色谱分析。五、衍生化方法制备衍生化的目的：①增加被测组分的热稳定性；②增加被测组分的挥发性；③减少被测组分在样品制备过程中因吸附性强导致的损失；④改善组分的层析行为，即制备成衍生物之后易于同其他组分分开；⑤增加被测组分对有关检测器的灵敏度和选择性。第三节高效液相色谱法仪器简介常用色谱分离方法及其应用反相液－液分配色谱离子对色谱制备高效液相色谱直接进样分析法手性药物的高效液相色谱法定量分析方法一、仪器简介贮液瓶泵进样器过滤器色谱柱检测器记录装置废液高效液相色谱仪示意图1.流动相流动相使用注意事项：（1）尽量选用纯度高的溶剂，以保证良好的分离效果和较小的基线本底。试剂的级别：色谱纯；水：重蒸水（2）滤除不溶性颗粒，以保护泵和色谱柱。过滤：0.45μm的微孔滤膜（水膜、有机膜）（3）脱气，以保持基线稳定。（有气泡，柱压不稳，基线起伏）方法：超声或过滤（4）混合均匀（脱气可达到此目的）（5）pH应符合色谱柱的要求，否则柱床破坏，柱寿命缩短。2.高压泵（输液泵）可用于控制流速，流速过高，柱压高3.进样进样器进样阀流动相样品流动相4.色谱柱分离的核心部分(1)色谱柱的分类类型不同，填料不同药物分析中，多用硅氧烷型化学键合固定相极性键合固定相：氨基、氰基键合相，分析极性、中等极性药物中等极性键合固定相：醚基键合相，分析中等极性、弱极性药物非极性键合固定相：十八烷基键合相，分析非极性、弱极性药物（2）色谱柱的维护A、样品和流动相中要除去大分子杂质和颗粒，尤其是样品中的蛋白质。以免柱头阻塞，柱子寿命缩短。B、流动相的pH值在适当范围内。（必须）C、用无机缓冲液做流动相后，应先用水冲洗，再用甲醇冲洗。（注意：一般C18色谱柱不宜用纯水冲洗，可用含低浓度甲醇水冲洗）D、长期使用后柱效降低，可照说明书依次用不同浓度的溶剂冲洗，使柱子再生。E、使用预柱（保护柱），主要用以吸附流动相和样品中的杂质，以防分析柱被污染，延长分析柱的寿命。F、每次停止使用时，都要清洗柱子。长期保存时，柱子中要有合适的溶剂（甲醇或乙腈），避免填料干燥。5.检测器（1）紫外检测器：应用最广泛，适用于有紫外吸收的药物，灵敏度高，对环境温度及流速波动不太敏感，适用于梯度洗脱。A、固定波长检测器：只能在一个波长处测定，一般为254nm。B、可调波长检测器：190～700nm范围内均可测定，应用最多。C、二极管阵列检测器（PDAD）：可在一秒钟内完成一次从200～800nm波长范围的连续扫描，因此可同时获得样品的色谱图（用于定量）和每个色谱组分的光谱图（定性，鉴别色谱峰纯度）。三维示意图三组分混合物的三维图（2）荧光检测器（FD）比紫外检测器有更高的灵敏度和选择性。检测限可达10-10g/ml，只适用于能产生荧光或能转变为荧光衍生物的药物。（3）电化学检测器（ECD）包括：电导检测器、极谱检测器、安培检测器（AD）AD：适用于具有氧化还原性质的化合物的检测。检测限可达10-12g/ml。工作原理：利用组分的氧化还原反应产生电流的变化而进行检测。（4）蒸发光散射检测器（ELSD）工作原理：携带组分的流动相蒸发室流动相蒸去样品组分气溶胶检测室强光或激光散射光散射光强浓度信号质量型检测器，其色谱峰的面积只与峰中所含物质的质量有关。通用型检测器，能测定所有化合物，与化合物的物理、化学性质无关。适用于挥发性低于流动相样品的组分。灵敏度较低，尤其是对紫外吸收的样品。故主要用于测定一些没有紫外吸收的物质，如氨基酸、糖类、磷脂、甾体等。注意：流动相必须具挥发性，如甲醇－水、乙腈－水。不能用含无机缓冲液的流动相，若调pH值可用NH3－H2O，CH3COOH等。特点：二、常用色谱分离方法及其应用HPLC1.液－固吸附色谱（LSC）2.液－液分配色谱（LLC）3.离子交换色谱（IEC）4.空间排阻色谱（SEC）5.亲和色谱（AC）6.假相色谱法（PPC）7.手性色谱法（CC）8.毛细管电泳法（CE）胶束色谱（MC）环糊精色谱（CDC）胶束色谱（MC）凝胶渗透色谱（GPC）凝胶过滤色谱（GFC）一般IEC离子色谱（IC）氨基酸分析（AAA）正相LLC（NLLC）反相LLC（RLLC）一般RLLC离子对色谱（IPC）离子抑制色谱（ISC）键合相色谱（BPC）液－液分配色谱利用样品组分在两种不相溶的液体（流动相和涂渍在载体上的固定相）间的溶解度或分配系数的差异来进行分离。按照固定相和流动相的极性差别，液－液分配色谱分为正相色谱（NP－HPLC）和反相色谱（RP－HPLC）。NP－HPLC：流动相极性小于固定相极性RP－HPLC：流动相极性大于固定相极性RP－HPLCNP－HPLC固定相极性流动相极性组分流出顺序流动相极性增加时低（非极性）高高低极性高的组分先流出极性低的组分先流出保留时间增加保留时间缩短RP－HPLC（体内药分中应用广泛）最常用的固定相：十八烷基硅烷键合相（ODS或C18）最常用的流动相组成：甲醇－水、乙腈－水。四氢呋喃、有机酸、缓冲盐。优点：1.可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处理后进样，简化操作。尤其适用于测定含有极性药物或代谢物的体液样品。2.体液中内源性杂质多数为极性大的化合物，往往先于药物流出色谱柱，色谱图上这些杂质峰出峰较早，减少了对药物峰的干扰，且有利于及时再进样。制备高效液相色谱法用高效液相色谱法分离制备、纯化样品组分的方法。制备型色谱柱：实验室内径20－40mm，长10－30cm1、分离条件的选择：固定相：与分析型色谱柱相同，但粒径较大。流动相：等度洗脱(分段)，溶剂纯度高，易挥发。流速：与分析柱比，流速大，目的是为了与分析柱维持相同的保留时间一般原则：流量之比是柱内径之比的平方。2、上样量的影响质量超载：脱尾，保留时间缩短。体积超载：平头峰，半峰宽等于柱头样品宽度。质量体积都超载：平头、脱尾样品溶液不能过浓，否则出现局部超载；溶剂强度不能超过流动相强度，否则破坏色谱柱内平衡。3、检测器的选择非破坏性、线性响应范围宽、灵敏度要求不高。4、分离样品组分收集馏分收集器：自动、手动。与检测器的连接管路不能太长。与相邻色谱峰重叠部分可进行再循环（四）直接进样分析法测定生物样本时一般通过预处理，从而达到分离纯化，浓集，易于测定等目的。随着反相高效液相色谱的广泛应用以及近年来固相萃取技术和柱切换技术的发展，直接进样分析在体内药物分析中的应用日益增加。（一）直接进样与沉淀蛋白进样直接进样：用于反相HPLC，样品浓度足够大，达到检测灵敏度；且含蛋白质量极微，不会污染堵塞色谱柱。如：尿液。简单除蛋白后进样：血清、血浆。蛋白沉淀剂：甲醇、乙腈、三氯醋酸等。缺点：使样品稀释，适用于浓度大的生物样品。适用于：药物或代谢物极性很大，难于用有机溶剂提取时。（二）柱切换技术柱切换技术是指用阀来改变流动相走向及流动相系统，使洗脱液在特定的时间内从预处理柱切换到分析柱上的一种技术。1、柱切换高效液相色谱法在体内药物分析中的应用（1）样品沉淀蛋白后进样样品中加入蛋白沉淀剂（甲醇、乙腈、三氯醋酸）去蛋白后，将上清液大容量进入预处理柱（短、粒径小5－10μm），组分保留在预处理柱上，杂质被冲掉，从而起到净化浓缩的作用。注意：预处理流动相应选择水或适当浓度有机溶剂的水溶液，以便使被测组分被保留。且沉淀蛋白后的上清液需加入适当体积的水稀释，以降低有机溶剂的浓度，防止被测组分在净化过程中从预处理柱上被洗脱。（2）体液直接进样（在线去蛋白）在以水为主的预处理流动相的引导下，可将大体积的体液样品直接进入预处理柱（短、粒径大25－40μm），在水冲洗下除去蛋白质和一些极性内源性杂质，被测组分则保留在预处理柱上，得到净化和浓缩；然后切换，以分析流动相将被测组分从预处理柱冲至分析柱，进行再分离测定。（3）全血或组织匀浆直接进样关键是预处理柱必须使用粗粒径的固相填料（50－90μm）和较大孔径的柱滤板，以便使血细胞易于通过预处理柱。（4）其他在线透析、在线衍生化等2、柱切换HPLC的主要优点（1）使液－固提取技术与HPLC分析技术结合，具有样品制备和样品测定双重功能。（2）样品前处理简单且自动化（3）被测样品组分富集提高了检测灵敏度（4）精密度高(五)手性药物的高效液相色谱法1.概述对映异构体：空间结构不能重叠，互为镜像关系的立体异构体。相应的药物称为手性药物。为什么必须对手性药物进行研究：（1）实际上是不同的化合物，它们与体内的大分子的不同立体结构结合，可产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，从而导致药物动力学参数的变化。（2）可能具有不同的药理和毒理作用，甚至产生药效拮抗，也可能其中一个对映体导致药物的不良反应。例：沙利度胺。2.HPLC分离手性药物的方法（1）间接法：柱前衍生化法定义：是药物对映体在用HPLC分离前，先与具有高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应，在药物对映体中引入另一个手性中心，形成非对映异构体，再以常规HPLC法进行测定。（2）直接法①手性流动相法（CMP）是在流动相中加入手性添加剂，使其与待测物形成非对映异构体复合物。根据其形成复合物的稳定常数不同而获得分离。②手性固定相法（CSP）是在色谱柱的担体加上高光学纯度的手性异构体而成，从而达到分离手性异构体的目的。三、定量分析方法XY药物浓度X，样品响应值Y1、药物浓度X是药物标准品在生物基质中的浓度2、响应值Y常用内标法中药物与内标响应值的比值峰高：峰锐、对称，对分离度要求不高峰面积：峰宽，分离度要求