色谱定性定量分析方法

ChinaPharmaceuticalUniversity色谱定性定量分析方法CompanyLogo一、色谱定性分析方法保留时间tr相对保留时间RRT，t/tr相对保留值α,(t-t0)/(tr-t0）保留指数ICompanyLogo色谱高分离能力，但鉴别结构的能力较弱。光谱能提供丰富的结构信息，但是对分析物纯度较高。二、色谱-光谱联用技术定性广泛用于药物中的杂质、体内外代谢产物的结构鉴定CompanyLogo气相色谱-质谱联用多用于分离易挥发、热稳定、极性小的化合物GC-MS：采用EI离子源。EI：获得分子离子峰及丰富的分子结构信息；CompanyLogo：采用API离子源;一级质谱获得分子量信息；高裂解电压（CID）或二级质谱（MS/MS）获得分子结构信息。液相色谱-质谱联用CompanyLogo例：盐酸乙哌立松片主要降解产物的定性鉴别CH3CH2COCHCH2CH3N.HClCompanyLogo鉴定要点：1、利用LC-UV选择最佳LC分离条件，并确定主峰与降解产物的峰位；供试品溶液的LC-UV图CompanyLogo、选择合适的离子源，利用LC-MS获得杂质的准分子离子峰。LC-ESI-MS的总离子流色谱图LC-APCI-MS的总离子流色谱图CompanyLogo获得降解产物准分子离子峰的裂解信息。方式一：在APCI条件下采用较高的CID电压或二级质谱裂解m/z175.3，获得碎片信息；方式二：在GC-MS(EI)质谱获得分子离子峰及其裂解途径；CompanyLogo、利用原药的质谱裂解途径确定降解产物的可能结构；CH3CH2COCCH3CH2杂质YJ的结构CompanyLogo、分析物质结构，确定色谱分离模式；2、以常用检测器（GC:FID/LC:UV）为手段，优化色谱分离条件，确定待鉴定组份峰位；CompanyLogo、根据化合物结构，选用合适的光谱技术鉴定；4、依据光谱信息进行结构鉴定：根据质谱提供的分子量和分子碎片信息，结合原药的光谱信息初步推断未知物结构；CompanyLogo三、色谱定量分析方法1、色谱信号的测量:色谱峰峰高与峰面积反映检测器对样品的响应值，定量分析中峰面积更为常用；2、定量分析的方法面积归一化法；外标法；内标法；标准曲线法CompanyLogo三、不同检测器的色谱信号与物质浓度关系FID、ECD、UV检测器的响应（峰面积）与样品的浓度呈线性关系；ELSD响应的自然对数与样品的浓度或质量呈线性关系；质谱（MS-ESI）检测器高浓度时的响应与样品的质量可能呈二次或更复杂的方式。CompanyLogo四、色谱分析方法验证目的：证明所采用的色谱分析方法适合于相应的检验要求，判断能否用于药品分析。效能指标：评价分析方法的尺度效能指标包括:精密度、准确度、专属性、检测限、定量限、线性与范围、耐用性、稳定性、系统适用性等CompanyLogo药品质量标准分析方法验证药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则不同分析测定方法的要求CompanyLogo①专属性（specificity）:意义：指有其他成分可能存在情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。内容：药物制剂含量测定时的专属性考察内容：A、杂质中间体与主成份的分离情况；B、破坏性试验产生的降解产物与主成份的分离情况：酸、碱、热、氧化、光破坏C、辅料是否干扰测定。CompanyLogo②准确度（accuracy）：意义：测量值与真实值接近的程度。药物制剂的含量测定以回收率表示。内容：即通过在空白基质中加入已知量不同浓度的对照品，比较测定值和加入值确定。一般在期望浓度的80%、100%、120%三个水平量，各测定三次，回收率均值在98-102%。CompanyLogo③线性范围（linearityrange）：意义：待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围；内容：用不同浓度对照品溶液分析测定（至少5种），以峰面积与浓度进行线性回归。制剂分析时方法要求r不小于0.999；生物样品分析要求r不小于0.99，与准确度的要求有关系。注意：与定量方法中标准曲线法的异同。CompanyLogo④精密度（precision）：意义：同一样品多次测量值之间相互接近的程度。内容：重复性:同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性:不同实验室，不同人测定的精密度制剂分析时精密度RSD应不小于2%。CompanyLogo⑤检测限和定量限（LODandLOQ）：意义：LOD是能检测到的最低量，S:N=3:1。LOQ是能定量测定的最低量，S:N=10:1。内容：生物样品分析时定量下限即为标准曲线最低浓度点，定量上限即位标准曲线最高浓度点。CompanyLogo⑥稳定性（stability）：意义：考察分析样品与试剂在一定时间内稳定性。内容：根据样品与试剂测定时实际可能所处的环境进行考察。CompanyLogo⑦耐用性（robustness）：意义：考察测定条件发生小变动时测定结果的变化。内容：流动相的组成和pH、商品柱的品牌尺寸、柱温等CompanyLogo⑧系统适用性（systemsuitabilitytest）：意义：保证分析系统适用于定量分析。内容：条件优化时考察，包括理论塔板数、分离度、拖尾因子，考察进样精密度。