建立PCR实验室的基本条件

建立PCR实验室的基本条件临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断，由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR技术要求高、影响因素多（特别是RNA标本），实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是PCR技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。二、PCR实验室验收准备工作（一）硬件准备——实验室基本建设1.根据文件要求，临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。2.各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。3.进入各工作区域必须严格按照单一流向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。4.不同的工作区域使用不同的工作服（不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。5.工作区域仪器设备配置标准试剂贮存和准备区2～8℃和-15℃冰箱：混匀器；微量加样器（覆盖1～1000μl）；移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。标本制备区2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速台式冷冻离心机；混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器（覆盖1～1000μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；超净工作台，消耗品；一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪；微量加样器（覆盖1～1000μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。扩增产物分析区视检测方法不同而定。基本仪器设备如下：微量加样器（覆盖1～200μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。（二）软件建设——质量手册编写与实施、人才资源（上岗证培训与相关知识学习）1.临床基因扩增检验实验室的质量手册编写质量手册是阐明临床基因扩增检验实验室的质量方针，并描述过其质量体系的文件。质量手册规定了质量体系的基本结构，是实施和保持质量体系应长期遵循的文件。临床基因扩增检验实验室质量手册编写应依照卫生部下发两个文件，并结合本实验室实际情况编写适合本实验室的切实可行的质量手册。质量手册的提纲应包括三部分：质量方针和宗旨；工作制度；标准操作文件（SOP）（1）质量方针和宗旨制定临床基因扩增检验实验室的质量管理目标和质量保证体系的结构体系和总方针。（2）工作制度一般应包括以下文件：实验室的设置、布局及组织结构；实验室内务管理制度；实验室的人员配置及管理制度；生物的防护与安全制度；实验室废弃物处理制度；实验室清洁消毒制度；仪器设备的管理制度；仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度；临床标本的管理制度；实验室记录的管理制度；质量控制工作管理制度；结果报告管理制度；抱怨的内部处理制度；负责人及质检员职责；岗位设置和责任制等……（3）标准操作程序（SOP）一般包括：消毒液配制标准操作程序：消毒标准操作程序；超净工作台使用标准操作程序；超净工作台维护和保养标准操作文件；PCR仪使用标准操作程序；PCR仪维护和保养标准操作程序；高速低温离心机使用标准操作程序；移液器使用标准操作程序；冰箱维护和保养标准操作程序；电热恒温水浴箱操作程序；电子天平使用和校正操作程序；可移动紫外消毒车使用操作程序；加样器校准标准操作程序；离心机维护保养操作程序；温度计校准程序；试剂的质检操作程序；标本唯一标识编号编制规则；临床标本的采集及处理操作程序；临床标本的保存程序；乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；丙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测标准操作程序；沙眼衣原体核酸扩增荧光检测标准操作程序等……（4）引用图表：PCR扩增可接受标本记录表；PCR扩增拒收标本记录表；室内质控结果记录表；室间质控记录表；消耗性材料验收记录表；试剂验收记录表；故障处理表；台阶式高速离心机使用记录表；台式高速冷冻离心机使用记录表；扩增仪维护保养记录表；人员培训计划及培训记录表；实验室工作人员一览表；主要设备一览表；实验室清洁消毒记录表；工作区温度、湿度记录表；抱怨记录表；标本超低温保存记录表；应急处理记录表；垃圾处理记录表；冰箱温度记录表；水浴箱温度记录表；移动紫外消毒车记录表；设备校正记录表；检测结果报告流程；报告单样张；临床送检标本流程图；实验室组织结构图。为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：1）PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。2）组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。3）用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。4）DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。5）大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。6）管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。7）任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。2、样品准备和RNA-PCRRNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。3、前PCR区必须有专门用于准备各种反应的区域，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。4、PCR实验室试剂的操作1）所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。2）所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。3）在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。4）所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。5）所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。6）新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。7）样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。5、在前PCR区建立PCR混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。2）如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。3）作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。4）阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。5）当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。6）由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。6、控制污染的方法已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。7、PCR仪的位置8、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单（卫生部推荐）序号仪器设备、辅助材料名称放置地点1冰箱试剂准备区2紫外线消毒灯试剂准备区3混匀器试剂准备区4可调式移液器（1-10µl），(5-40ul)，(20-200ul)一套三把试剂准备区5高速台式离心机试剂准备区6专用工作服和衣柜试剂准备区7冰箱样品准备区8紫外线消毒灯样品准备区9生物安全柜B2级样品准备区10冷冻高速离心机（丙肝专用）样品准备区11恒温金属浴样品准备区12混匀器样品准备区13可调式移液器(5-40ul)，(20-200ul)，(200-1000ul)一套样品准备区14专用工作服和衣柜样品准备区15紫外线消毒灯PCR扩增区和产物分析区16可调式移液器（1-10µl），(5-40ul)，(20-200ul)一套PCR扩增区和产物分析区17专用工作服和衣柜PCR扩增区和产物分析区18荧光定量PCR检测仪PCR扩增区和产物分析区所有四区均需准备的仪器设备为：专用工作服和工作鞋专用办公用品一次性手套、一次性吸水纸可移动紫外灯（近工作台面）微量加样器一套（覆盖1~1000ul）以上物品各一套。试剂贮存和准备区2~8℃和-15℃冰箱混匀器（可加热）耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）天平高压锅标本制备区2~8℃冰箱和-20℃或-80℃冰箱高速台式冷冻离心机混匀器水浴箱或PCR仪耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）生物安全柜B2级超净工作台超声波水浴仪（处理大分子DNA用）三、扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）国产离心机四、扩增产物分析区酶标仪、洗板机、恒温箱（PCR—ELISA）加样器吸头（带滤心）电泳仪及电泳槽杂交仪核酸转移仪国产离心机