标本采集和保存技术要求一览表

附件1标本采集和保存技术要求一览表病人类型种类采集时间和频次采集方法保存条件备注所有病例全血1、入院后立即采集；2、间隔3－5天采集一次；3、逝前采集一次。真空采血管无菌采集血清分装2管血块单独保存低温保存，-70℃最佳，-20℃亦可血块用于细菌检测抗凝血入院后立即采集真空抗凝采血管无菌采集最好在使用抗生素前采血同上传染病所要求如5天内能送达实验室，可0℃~10℃保存，如否，可低温冷冻保存咽拭子入院后立即采集塑料杆拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头分别浸入含3ml病毒或细菌采样液的螺口塑料管中同上详见表下注。漱口液入院后立即采集10ml不含抗菌素的采样液漱口，无菌螺口塑料管收集同上详见表下注。尿标本1、入院后立即采集；2、临床检查采集标本时留样无菌管采集中段尿标本10ml同上详见表下注。便标本1、入院后立即采集；2、临床检查采集标本时留样无菌管采集粪便标本同上详见表下注。下呼吸道标本气管插管时采集采集呼吸道抽取物或分泌物同上详见表下注。痰液有痰液时采集同上详见表下注。心脏穿刺组织死亡后未做尸检时采集同上详见表下注肺穿刺组织心包病人类型种类采集时间和频次采集方法保存条件备注液胸腔积液尸检标本2份同上，1份福尔马林充分固定后，4℃保存应尽量多采集各器官组织标本，例如肺组织、胸腔积液、心脏组织、心包液、肝、肾、脾组织，如果有神经系统表现，还需采集脑组织以及其它可能受累的器官标本有明确脑膜脑炎或脑炎症状病例脑脊液急性期无菌采集同上有出疹症状病例疱疹液有疱疹时无菌采集同上注：1、以上标本分别用于开展病毒和细菌等病原体检测2、采集咽拭子标本、下呼吸道标本、痰液、心脏穿刺组织、肺穿刺组织、心包液、胸腔积液使用的样品保存液应不含抗生素或不用样品保存液，现场无菌接种，并将接种后剩余的标本立即冷冻（-20℃以下）保存。漱口液、尿标本和粪便标本现场无菌接种，并将接种后剩余的标本立即冷冻（-20℃以下）保存。附件2手足口病例标本送检登记表患者姓名性别出生日期年月日（阴/阳历）家长姓名家庭住址市乡（镇、街办）村（居）号家庭电话发病日期年月日初诊日期年月日；初诊单位（省级/市级/县级/乡级/村级）初步诊断：_______________________________住院治疗（是/否），如住院，则：入院日期年月日，入院诊断出院日期年月日，出院诊断病程天预后：痊愈/好转/未愈/死亡/其他；后遗症（有，；无）标本统一编号：标本类型采样日期送检日期是否冷藏标本量收样日期检测日期报告日期实验结果RDHEp-2中和抗体滴度咽拭子血清急性期恢复期粪便标本脑脊液疱疹液注：送检标本编号为“标本统一编号+标本类型”，其中“T”为咽拭子代码，“S1”为急性期血清代码，“S2”为恢复期血清代码，“F”为粪便标本代码，“CSF”为脑脊液代码，“H”为疱疹液代码。采样人：采样单位：送样人：附件3手足口病实验室检测方案（试行）为规范手足口病的标本采集、运送及实验室检测操作程序，提高检测准确性，从而为手足口病的明确诊断和相关实验研究提供可靠的依据，特制定本方案。手足口病的实验室检测原则和程序手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断（见下图：手足口病的实验室诊断流程图）。一般是由省级病毒实验室进行病毒的分离，爆发疫情范围较大时，国家参比实验室也可以提供技术支持。病毒分离成功后，送至国家参比实验室进行鉴定或复核，同时对全国手足口病的病原进行病毒学监测。国家参比实验室接到标本后，在30日内将结果反馈给省级实验室。很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD细胞（对CA16和EV71敏感）、HEp-2细胞（对某些柯萨奇B组病毒敏感）等，联合使用上述两种或更多细胞（如Vero细胞）有助于分离到更多的肠道病毒。使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验是肠道病毒鉴定的基本方法，如果使用了适当的抗血清，实验结果是比较可靠的。因为肠道病毒包括若干个血清型，通常使用组合抗血清进行鉴定，有些组合抗血清已经商品化。当无法进行病毒分离或得不到适用于病毒分离用的标本时，血清学检测可以为肠道病毒的感染提供一个间接的证据。一般用急性期血清与恢复期血清的检测结果进行比较，抗体滴度呈四倍或以上增高证明有急性感染。但是，无症状的肠道病毒感染也是常见的，所以对检测结果的解释要慎重一些。为了提高检测速度，也为了辅助中和实验法进行毒株鉴定，最近很多实验室都使用分子生物学方法。目前，用分子生物学方法对肠道病毒进行定型还没有统一的标准，而且要根据检测目的选择使用适用的方法。检测结果的评价如果从临床标本中分离到肠道病毒，尤其是分离自脑脊液、疱疹液，那么很可能该病毒就是病因病原。当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。对于难以分离到的肠道病毒，分子生物学方法如RT-PCR是很有用的。肠道病毒有时引起无症状感染，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。实验室诊断标准根据手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMD临床诊断，流行病学接触史有助于诊断，临床诊断病例中符合下列之一，即为实验室诊断病例：1，患者的粪便标本、咽拭子标本中病毒分离阳性率远高于对照人群；2，肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256；或恢复期血清中肠道病毒型特异性中和抗体较急性期有4倍或4倍以上增高；3，在病变组织中如疱疹液或脑脊液中分离到病毒；4，自患者血清、疱疹液或脑脊液等标本中检测到病原体核酸。一、标本采集对象标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病的临床诊断病例和病例发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构的5岁以下的儿童（作为健康对照人群）。用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。对于血清学诊断，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在0~8℃运输和保存。标本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如标本编号、发病日期和标本采集日期。二、标本种类及采集、运送（一）粪便标本采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（二）咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（三）血清标本采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（五）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（六）病例密切接触者的标本采集选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。（七）健康对照的标本采集选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。三、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值，但对于不同血清型的肠道病毒，脑脊液中的病毒分离率是大不相同的。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。四、实验室检测操作流程（一）病毒分离1.试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表生长液（GM）维持液（MM）Eagle`s液(MEM)86.5ml92.5mlL-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5mlP.S溶液*(青霉素及链霉素)1.0ml1.0ml（2）粪便标本的处理液完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500μg/ml。2．病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CA16）生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CA16的标本均需接种到以下两种细胞系：RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。3．标本的处理（1）粪便标本的处理操作步骤：1.1在离心管上标记标本号；1.2每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；1.4剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；1.5确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；1.6在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；1.7在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）；1.8一管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另一管存于4~8℃以备接种。（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于病毒分离。（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。4．接种和观察（病毒分离）（1）显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成；（2）倒掉生长液（GM），换上1~1.2ml的维持液（MM）；（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃（对于AHC标本的病毒分离，尤其是EV70的分离培养，强烈建议降低培养温度，一般可为34~35℃）；（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+~4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，25%;2+,25%~50%;3+,50%~75%;4+,75%~100%）；（8）如果有特征性的肠道病毒