4.发酵工业无菌技术

四、发酵工业无菌技术一概述发酵工业无菌技术在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因此所有发酵过程，必须进行纯种培养；特别是在种子移植过程、扩大培养过程以及发酵前期，如果杂菌一旦侵入生产系统，就会在短期内与生产菌争夺养料，严重影响生产菌正常生长和发酵作用，以致造成发酵异常。所以整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，强调无菌操作。一发酵工业的无菌处理一概述发酵工业无菌技术除了设备应严格按规定保证没有死角，没有构成染菌可能的因素外，必须对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体的污染。在好氧发酵时，通入发酵系统的空气，如果夹带有各类其他的微生物。这些微生物便会在培养系统合适的条件下大量繁殖，从而干扰纯种培养过程的正常进行，甚至使培养过程彻底失败导致倒罐，造成严重的经济损失。空气除菌不彻底是发酵染菌的主要原因之一。一概述发酵工业无菌技术灭菌指利用物理、化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽抱；二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术二发酵工业污染的防治策略污染的危害染菌是发酵工业的致命伤。轻者培养基利用率下降；产品分离困难；发酵异常；影响产品质量；重者造成“倒罐”；造成严重经济损失，扰乱生产秩序，影响生产计划。二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术在现有的技术条件下要做到完全不染菌是不可能的。目前要做的是要提高生产管理水平，尽可能防止发酵染菌的发生，而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把染菌造成的损失降低到最小。二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术不同染菌对发酵的影响如：青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大；高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大；二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术不同污染时期对发酵的影响种子培养期菌浓低，营养丰富；灭菌；发酵前期杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；发酵中期严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成；并罐、提前放罐等；发酵后期如杂菌量不大，可继续发酵；如污染严重，可采取措施提前放罐；二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术染菌对产物提取和产品质量的影响过滤：粘度加大；菌体大多自溶；基质残留浓度加大；降低过滤收率。萃取：水溶性蛋白质升高，易发生乳化；离子交换：杂菌易被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术杂菌污染的防治2.培养：平板、斜面3.肉汤培养方法：用这些方法没有发现染菌并不能肯定未被污染，还应结合其他异常现象来判断，如溶氧水平、CO2排放量、pH值等。1.镜检：染色（革氏、芽孢、鞭毛等）染菌的检查与判断二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术——正常发酵溶氧曲线；----异常发酵溶氧曲线；-．-异常发酵光密度曲线；谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶氧曲线二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术发酵染菌率和染菌原因分析染菌原因分析：发酵染菌率：一年内染菌批数占总的投料批数的百分率；发酵染菌率1.染菌的杂菌种类分析耐热性芽抱杆菌多是由于设备存在死角或培养液灭菌不彻底。球菌、酵母等可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的。霉菌大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术2.发酵染菌的规模分析大批发酵罐染菌：时期、种类；部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌；中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。个别发酵罐连续染菌和偶然染菌：个别发酵罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损等。二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术3.不同染菌的时间分析种子阶段发酵初期发酵后期二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术杂菌污染途径及预防1.种子带菌及防止：带菌的原因无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌不彻底；操作不当。种子带菌的防止种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。严格技术规范种子培养的设备和装置二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术无菌室室内布置应尽量简单，通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20~30分钟，配合使用化学灭菌药剂；无菌室内无菌度的要求是：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。灭菌锅灭菌操作时需要注意排气管是否畅通；二发酵工业污染的防治策略发酵工业无菌技术2.无菌空气带菌及防止；3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防止：原料蒸汽压力设备死角5.操作不规范引起的染菌4.设备渗漏引起的染菌及防止；第十一章工业发酵染菌的防治发酵染菌的拯救与处理1.种子培养期染菌的处理：灭菌，倒种；2.发酵前期染菌的处理：灭菌，接种；3.发酵中后期染菌的处理：发酵控制，提前放罐；4.染菌后对设备的处理：彻底灭菌；三发酵工业的无菌技术发酵工业无菌技术三发酵工业的无菌技术灭菌的方法有：干热灭菌法，湿热灭菌法，火焰灭菌法，电磁波、射线灭菌法，化学药品灭菌法及过滤除菌法。根据灭菌对象和要求不同选用不同的方法。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术四发酵培养基及设备管道灭菌生产中需要解决的问题：杀灭培养基中的杂菌避免培养基中营养成分的破坏发酵生产中主要采用湿热灭菌的方法四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术湿热灭菌原理微生物的热阻每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，如一些嗜冷菌的最适温度为5～l0℃；大多数微生物的最适温度为25～37℃；另有一些嗜热菌的最适温度为50～60℃。表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术当微生物处于最低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质体和酶的基本成分——蛋白质发生不可逆的变化，即凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术湿热灭菌就是根据微生物的这种特性进行的。杀灭细菌营养体采用较低温度即可；而芽孢细菌的芽孢能经受较高的温度。一般讲，灭菌的彻底与否以能否杀死芽孢为标准。杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术由于一般细菌、芽孢细菌、微生物细胞和微生物孢子，对热的抵抗力不同，因此，它们的致死温度和致死时间也有差别。微生物的这种对热的抵抗力常用“热阻”表示。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术相对热阻：指在相同条件下两种微生物热阻的比值。芽孢的热阻特别高的原因：①芽孢具有吡啶二羧酸，能增强对热抵抗力;②芽孢厚而且结构致密，热不易透过;③芽孢的游离水分少，蛋白质含水量较营养细胞蛋白质含水量低。在实际生产中，不能完全了解杂菌的数量和类型，以相对热阻大的芽孢作为灭菌的依据。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术微生物热致死是指微生物受热失活直到死亡，微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固，丧失活力所致。在一定温度下，微生物受热后，其死活细胞个数的变化如化学反应的浓度变化一样，遵循单分子反应速率理论。微生物热死灭动力学方程：对数残留定律四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断被减少。因此，微生物热死速率即微生物个数减少的速度与任一瞬间残存的菌数成正比。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术NKdtdN用N表示活菌个数，则活菌的减少率(死亡率)与N呈线性关系即：K：比热死亡速率常数，min-1四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术在恒定温度下，将方程积分，边界条件为：t：t0=0→t=t；N：N=N0→N=N；KtttNNeNNKtNNdtKNdN00ln00四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术灭菌操作中，为达到一定的灭菌要求，即N/N0为某值，如10-16。则所需灭菌时间即可由下式求出：NNKttKNNtKNN000ln1lnln该式叫做对数残留公式四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术若要求灭菌后绝对无菌，即N=0，则从公式可以看出灭菌时间将等于无穷大。在生产上，通常取N=10-3个/罐为计算标准，即微生物污染降低到处理1000罐中只残留1个活微生物的程度，此数已能满足生产的要求；这样对于不同N0的培养基，其灭菌时间不同，即t=t(N0)。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术根据0ln1NNKt在给定的温度条件下，t与lnN0/N呈直线关系，其斜率为-1/K；当N0给定后，t决定于K；K除了决定于菌体的种类及存在形式外，还是温度的函数。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术※非对数残留定律：菌体循序死亡模型某些菌体受热死亡的速率不符合对数残留定律。将其N/N0对灭菌时间t在半对数坐标中标绘得到残留曲线不是直线，这主要是菌体以芽孢形式存在的原因。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术对耐热性的微生物芽孢死亡规律的描述，具有代表性的模型为Prpkop&Humphey提出的“菌体循序死亡模型”。该学说认为：芽孢的死亡是渐进的，由耐热的芽孢（R型）转变为死亡的芽孢(D型），需经过敏感的中间过程（S型）。DkskRNNNsR四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术tkkktkkkkNNNkdtdNNkNkdtdNRRsssRRtRRRssRRsexpexp0四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术灭菌温度、时间选择温度对化学反应的影响特别显著,主要是影响速度常数Arrhenius方程(1889)RTEeAK四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术表明：lnK与1/T之间呈直线关系，其斜率为–ΔE/R，在不同T时做灭菌试验，求得相应的K值，即可求出ΔE。两边取对数由RTEeAK:ARTEKlnln四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术TEKK,求导两边对将TARTEKlnln以上可以看出：ΔE同T一起决定K值，即：2RTEdTKdln四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术的影响愈大。的变化对亦即变化率愈大愈高即正相关其值与即的变化率对表示KTEETKTKdTKd,,:,ln,lnln四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术以上结论非常重要：在生产上，可利用菌体死灭反应与营养成分被破坏反应的ΔE差距来作为工艺选取的依据。通常，菌体死灭反应的ΔE约在200～400KJ/mol，而维生素被破坏的ΔE约在8～100KJ/mol，灭菌中，温度升高，菌体死灭速度的增加远大于营养成分被破坏的增加；这就是高温短时间灭菌的依据。四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术K(min-1)1/T(K)嗜热脂肪芽孢杆菌维生素B1abABCD当温度从a→b时维生素破坏的K值增加为A→B；而芽孢杆菌死灭的K值增加为C→D；其增加幅度远大于维生素被破坏程度的增加；四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术影响培养基灭菌的因素除了所污染杂菌的种类、数量、灭茵温度和时间外。培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。影响培养基灭菌的其他因素四发酵培养基及设备管道灭菌发酵工业无菌技术(1)培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞的周围形成一层薄膜，影响热的传递，因此在固形物合量高的情况下，灭菌温度可高些；例如，大肠杆菌在水中加热60-65℃便死亡；在10％糖液中，需70℃4-6min，在30％糖液中需70℃30min。低