发育生物学

Morphogenesis:VertebrateLimbDevelopment第十四章附肢的发育和再生附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题。脊椎动物，特别是鸟类和两栖类附肢（limb）的发育包含了大量的、各种各样的诱导作用。有尾类的蝾螈和美西螈附肢具有明显的再生能力，是研究再生的极好模型。一、脊椎动物附肢的发育脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官，每一块骨和肌肉的位置都被精密地组织在一起。附肢在三个基本轴上是不对称的，但左前肢总是和右前肢呈镜面对称。脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层和外部的表皮共同组成的。鸡翅内骨的排列模式及其不对称性脊椎动物附肢由体壁中胚层和外部表皮共同形成，这些附肢的骨头主要包含3个部分：靠近体壁的stylopod(如：肱骨humerus或股骨)，中段为zeugopod(如：桡尺骨ulna或胫腓骨radius)，metacarpal（掌骨），最远程的是autopod(如：腕骨-手指digits或跗骨-脚指)。孵化10天的完整鸡翅标本，示三个发育轴：近侧-远侧轴、前后轴及背腹轴。在所有的四足动物中，附肢发育的基本形态发生原则（basicmorphogeneticrules）是相同的。构建一个附肢所需要的位置信息要在一个三维（或包括时间在内的四维）的、相互协调的系统中发挥作用。现在已鉴定了一系列蛋白，在附肢近远轴、前后轴和背腹轴的形成过程中发挥作用。1、附肢的起源脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向外生长形成的，主要是由来自中胚层的疏松间质形成的中央核，以及来自外胚层的表皮两大部分组成。附肢的原基称为附肢芽（limbbud）。附肢芽形成的位置在每一物种是恒定的，由Hox基因沿身体前后轴表达的水平决定。鸡胚胎的肢芽。孵化后第三天胚胎的侧面出现肢芽翅肢芽腿肢芽顶外胚层嵴许多脊椎动物胚胎中的预定附肢区（prospectivelimbarea）已被定位。能形成一个附肢的所有细胞，称为附肢场（limbfield），包括位于中央的、产生附肢本身的中胚层细胞（附肢盘，limbdisc）以及形成周围的躯干组织和肩带/腰带的细胞。附肢场起初具有调节失去或增加部分附肢的能力，附肢场中的每个细胞都能被指令形成附肢的任意一部分－调和等能系统。美西螈（Ambystomamaculatum）的预定前肢场前肾肩带腮周侧翼组织附肢腮体节太平洋树蛙（Hylaregila）的早期后肢场被许多寄生的线虫卵分隔开，形成多附肢的蝌蚪，示附肢场的调整能力。2、附肢的早期发育附肢早期发育的第一个迹象是体节中胚层细胞沿胚胎长轴的增殖，逐渐在表皮的下面形成厚的细胞团,它们从附肢场的侧板中胚层和体节中胚层分离出来，进而转变为间质细胞进行迁移。附肢的发育开始于间质细胞从附肢的骨骼前体细胞(limbskeletalprecursors)和附肢的肌肉前体细胞(limbmuscleprecursors)分离后的增殖，这些细胞在内胚层组织下聚集并形成一环状的突起，此突起称为肢芽。两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解生肌节生骨节脊髓前肾生皮节轴下生肌节芽轴上生肌节芽附肢芽肌肉前体附肢芽骨骼前体内胚层侧板中胚层脊索Inductionoftheearlylimbbud:Wntproteinsandfibroblastgrowthfactors(FGFs)肢芽形成的信号来自于侧板中胚层(lateralplatemesoderm)细胞，这些细胞会分泌成纤维生长因子FGF10，而FGF10能够促使外胚层和中胚层之间分肢形成的交互作用。当含有FGF10的小珠子被放置于侧翼内胚层下方，会有额外的分肢形成。(A)在分肢正常形成之处的侧板中胚层lateralplatemesoderm里，有FGF10表现。(B)当将会分泌FGF10的细胞转植于鸡胚的侧翼时，FGF10会使一异位的分肢形成。FGF10的表达及其在鸡肢发育过程中的作用Wntproteinsandfibroblastgrowthfactors(FGFs)FGF10原本分布于整个侧板中胚层，但是在附肢形成之前，FGF10便被限制在侧板中胚层将形成附肢的区域，FGF10被限制主要与Wntproteins有关。孵化48－54h鸡胚附肢芽开始形成的分子模型如图所示，一开始FGF10表现于整个侧板中胚层，然后在后肢形成之处，受到Wnt8c限制。而在前肢形成之处，则受到Wnt2b限制。FGF10经由外胚层的Wnt3a来诱发顶外胚层嵴(AER)中的FGF8表现，FGF8能诱导并维持Wntproteins表现，使得FGF10于侧板中胚层内能连续性地表现。顶外胚层嵴前肢、后肢的分化Gain-of-function实验结果表明，转录因子TBX4和TBX5分别与后肢和前肢的特化有关。Loss-of-function资料也表明，人类TBX5基因缺失会导致上肢和心脏的异常，但下肢基本不受影响。TBX4和TBX5在肢型特化中的作用Tbx5(蓝色)表现于前端的侧板中胚层，此部分的肢芽将形成翅膀；Tbx4(红色)表现于后端的侧板中胚层，此部分的肢芽则形成腿。倘若将含有FGF的小珠子植入表现Tbx4和Tbx5之间的区域，则在此区域前端诱发Tbx5表现，于后端诱发Tbx4表现，所以此区域的分肢将同时形成翅膀和腿的构造。TBX4和TBX5在FGF10诱导形成的肢芽中的表达异位表达TBX4，可以使FGF10诱导形成的前肢转变为后肢apicalectodermalridge(AER)在鸟类和哺乳类中胚层诱导肢芽顶端前、后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚的特殊结构，称为顶外胚层嵴（AER)。这个脊状的构造会跟肢芽指状的边缘一起移动，并且会变成发展中四肢的主要信号中心。它扮演以下几种角色：(1)维持它下面的间质细胞处于一种可塑、增生的阶段，使之能够完成肢干近－远端(proximal-distal)的生长；(2)使那些可以引起前－后轴(anterior-posterioraxis)(亦即，拇指到小指)形成的分子维持在一定的表现量；(3)与能够特化前后轴跟背腹轴(dorsal-ventralaxis)的蛋白质相互作用，如此一来每个细胞就能得到如何来分化的指示。扫描电镜观察孵化4.5天的鸡胚肢芽，显示顶外胚层嵴AER。附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的相互作用。一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。中胚层在附肢发育中也起着关键的作用。AER起初的形成和继续存在依赖于位于其下方的中胚层。AER与位于其下的中胚层的相互作用渐进带(PZ)在附肢发育中的作用渐进带位于肢芽的顶端，由快速分裂和增值的未分化细胞组成。顶外胚层嵴位于渐进带的上表面。不同时期的ZP细胞的移植对附肢发育有着不同的影响(见下图)AER对下方的渐进带发出信号，如将AER移植到早期肢芽的背部将诱导异位生长。Themajorsignalisfibroblastgrowthfactors,FGF-8throughoutridgeandFGF-4intheposteriorregion.渐进带（PZ）细胞控制近－远端分化A.将早期翅芽的PZ移植到已经形成尺骨和挠骨的晚期翅芽中，形成额外的尺骨和挠骨。B.将晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中间结构缺失。附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间的相互作用：第一，中胚层起始附肢芽向外生长和形成AER；第二，AER进一步刺激肢芽的向外生长以及肢芽中胚层的增殖和分化；第三，附肢芽中胚层提供保持AER所必须的刺激。附肢发育时期轴的建立脊椎动物完全形成的附肢包括三个轴的发育，分别是近－远（P/D)轴、背－腹(D/V)轴和前－后(A/P)轴。附肢发育中三个轴的建立具有各自的时间性，其顺序可能是：A/Paxes－D/Vaxes－P/Daxes。近远轴（P-D)的发育附肢沿近远轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。附肢芽的逐渐向外生长是由于位于AER下面间质细胞的增殖，而AER释放的分子维持间质细胞不断进行分裂。由AER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子FGF可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。如果AER在肢干发育的任何时期被移除，则末端肢更进一步的骨骼发育将会停止如果有过多的AER移植到一个已经存在的肢芽上，会形成多余的构造，此构造通常接近肢干的末端。如果腿部的间质组织直接被置放在翅膀的AER下，后肢的末端构造(脚指)会生长在翅膀的末端如果在AER下的肢干间质组织被非肢干的间质组织取代，那么AER会退化，并且枝干的发育会停止如果AER被一个装有FGF的有孔小珠所取代，那么仍然可以发育成正常的肢干在肢干发育中，越早移除AER，则肢干的缺失越大。上图分别为在第三天、第三又二分之一天、第四天移除AER以及不移除AER对翅膀生长的影响。顶外胚层嵴（AER)对于肢芽近远轴图式的发育是必须的生长因子可以替代顶外胚层嵴。将AER切除后，移植能释放生长因子FGF-8的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。Specifyingthelimbmesoderm:DeterminingtheP/Dpolarityofthelimb附肢沿P/D轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。PZ的间质细胞在其中起到重要作用。但是这些间质细胞如何特化近-远轴？有两个模式被提出来解释这个现象：①渐进带模式（progresszonemodel）重视“时间”的量度②早期定位与扩散模式（earlyallocationandprogenitorexpansionmodel）重视“空间”的量度渐进带模式（progresszonemodel）Progresszonemodel是假设每个中胚层细胞被分化的原因，是由它在渐进带(progresszone;PZ)中分裂所花的时间长短来决定。一个细胞在增长区所花的时间越长，它获得越多有丝分裂的机会，而其构造越往远程发展。既然增长区要维持一定的大小，当肢干生长时，细胞必须不断离开增长区；一旦细胞离开，他们就形成软骨组织。所以，第一个离开的细胞会变成stylopod(靠近体侧部分，如肱骨)，而最后离开的细胞形成autopod(远离体侧部分，如指骨)，见下图(A)早期定位与扩散模式Earlyallocationandprogenitorexpansionmodel认为肢芽在很早就已经分化了，后来的细胞分裂只是扩张已经分化的区域，见下图(B)。当早期将AER移除的时候，这些特化的区域还没扩张，所以大部分的间质细胞(在AER200μm之内)都死亡了，但当在较后期的胚胎阶段，肢芽生长且区域扩张了，200μm的范围只会删除掉autopod的部分。间质细胞特化近-远轴的两种模式Hoxgenes,meisgenes,andthespecificationoftheP/Daxis同源基因(homologousgene)在附肢发育中起到重要作用，它可以用于解释附肢发育中的所有主要现象。包括Hoxgenes决定附肢域(limbfield)，Hox-Dgenes决定指的特化等。同源基因比较右图(A)为正常老鼠的前肢，而图(B)为Hoxa-11与Hoxd-11两基因都已突变失去功能的老鼠前肢，其桡骨跟尺骨皆已消失。Hoxgenes在P/Daxis形成中的作用Hoxgene特化前肢特定部分的假设Hox-9特化肩胛骨，Hox-10特化肱骨，Hox-11特化尺骨跟桡骨，Hox-12特化掌骨，Hox-13特化指骨。Hox基因在四肢形成期间的表现量改变情形。在肢柱形成时(phaseⅠ)，Hoxd-9与Hoxd-10表现在新形成的肢芽。而在形成肢杆时(phaseⅡ)，Hoxd-9到Hoxd-13都有表现在肢芽的后端，但只有Hox-9在前端跟后端都有表现。在肢身形成时，Hox基因的表现相反过来，Hoxd-13和Hoxa-13在前端跟后端都有表现，而Hoxd-10到Hoxd-12以及Hoxa-12表现在后端。Hox基因和附肢畸形附肢畸