第4章--发酵工业无菌技术

第4章发酵工业无菌技术本章内容一、概念二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备灭菌五、空气除菌一、概念：灭菌、消毒、除菌、防腐灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。消毒与灭菌的区别消毒与灭菌在发酵工业中的应用二、发酵工业污染的防治策略（一）污染的危害（二）污染的防治1.染菌的不良后果消耗营养合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难改变pH分解产物噬菌体破坏极大2.染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响A．细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。B.霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C.酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌D.疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。（1）染菌对不同菌种发酵的影响（2）染菌种类对发酵的影响青霉素：怕染细短产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响种子扩大时期染菌:发酵前期染菌：发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定抗生素发酵柠檬酸发酵a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌b.污染酵母：加入0.025~0.035g/LCuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。灭菌后弃去应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响柠檬酸发酵c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。发酵后期污染染菌量不太多，可继续发酵污染严重，则提前放罐杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本；发现后加入，效果要具体评价（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。1.染菌的检查与判断显微镜检查法镜检出杂菌需要一定时间平板划线培养或斜面培养检查法：菌落噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑肉汤培养检查法发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化pH异常变化尾气CO2异常变化12污染原因分析主要原因：①种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底⑤操作失误⑥技术管理不善预防种子带菌的防治灭菌彻底接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠保藏可靠过滤空气带菌的防治设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治“死角”发酵罐的“死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀管道安装不当或配置不合理形成的“死角”污水脓疱罐底发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”法兰连接不当造成的“死角”灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂防止泡沫升顶连消不彻底：最好采用自动控制装置灭菌后期罐压骤变死角操作不当造成染菌噬菌体染菌及其防治预防采取哪些措施能够保持无菌发酵？物料、培养基、中间补料要灭菌；发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；好气发酵通入的空气要除菌；种子无污染；接种无菌操作过关；为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。有关细菌耐热性的特性（1）热力致死速率曲线或活菌残存数曲线微生物及其芽孢的热处理死亡数是按指数递减或按对数循环下降的。若以纵坐标为物料单位值内细胞数或芽孢数的对数值，以横坐标为热处理时间，可得到一直线——热力致死速率曲线或活菌残存数曲线。10100100010000012345加热时间（分）每毫升芽孢数图1热力致死速率曲线DDDDDD（2）D值图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟）就是D值（Decimalreductiontime）。也就是直线斜率的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。D值的定义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数时所需要的时间。D值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性越强。因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。注意：D值不受原始菌数影响D值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境和其它因素而异。部分食品中常见腐败菌的D值腐败菌腐败特征耐热性嗜热脂肪芽孢杆菌平盖酸败D121=4.0-5.0min嗜热解糖梭状芽孢杆菌产酸产气D121=3.0-4.0min嗜热菌致黑梭状芽孢杆菌致黑硫臭D121=2.0-3.0min肉毒杆菌A、B产酸产气产毒D121=6-12sec生芽孢梭状芽孢杆菌(P.A3697)产酸产气D121=6-40sec低酸性食品嗜温菌凝结芽孢杆菌平盖酸败D121=1-4sec巴氏固氮梭状芽孢杆菌产酸产气D100=6-30sec酪酸梭状芽孢杆菌产酸产气D100=6-30sec酸性食品嗜温菌多粘芽孢杆菌产酸产气D100=6-30sec表1瞬间加热和冷却条件下单位时间为D时的细菌死亡速率单位时间为D时的加热时间（分钟）单位容积残存活菌数0D1041D1032D1023D1014D1005D10-16D10-27D10-38D10-4从表1可以看出，从5D以后，为负指数，也就是说有1/10~1/10000活菌残存下来的可能。细菌和芽孢按分数出现并不显示，这只是表明理论上很难将活菌完全消灭掉。实际上，这应该从概率的角度来考虑，如果100支试管中各有1ml悬浮液，每ml悬浮液中仅含有1个芽孢，经过5D处理后，残存菌数为10-1，即1/10活10/100，也就是100支试管中可能有90支不再有活菌存在，而10支尚有活菌的可能。D值可以根据图1中直线横过一个对数循环所需的热处理时间求得。当然也可以根据直线方程式求得，因为它为直线斜率的倒数，即：batDloglog例1：100℃热处理时，原始菌数为1×104，热处理3分钟后残存的活菌数是1×101，求该菌D值。即D100℃或D110=1.0000.1100.1lg100.1lg34D110100100095100105110115120125杀菌温度(℃)杀菌加热时间(分钟)Z（3）热力致死时间曲线（TDT曲线）ThermalDeathTime：热力温度保持恒定不变，将处于一定条件下的悬浮液中某一菌种的细胞或芽孢全部杀死所必需的最短热处理时间。图2热力致死时间曲线细菌的热力致死时间随致死温度而异。它表示了不同热力致死温度时细菌芽孢的相对耐热性。与热力致死速率曲线一样，若以热处理温度为横坐标，以热处理时间为纵坐标（对数值），就得到一条直线，即热力。表明热力致死规律同样按指数递降进行。Z值的概念：直线横过一个对数循环所需要改变的温度数（℃）。换句话说：Z值为热力致死时间按照1/10，或10倍变化时相应的加热温度变化（℃）。Z值越大，因温度上升而取得的杀菌效果就越小。通常用121℃（国外用250F°或121.1℃）作为标准温度，该温度下的热力致死时间用符号F来表示，并称为F值。F值的定义就是在121.1℃温度条件下杀死一定浓度的细菌所需要的时间——F值与原始菌数是相关的。若T2=121.1℃，则t2=FZTTtt1221lg（4）热力指数递减时间（TRT）为了计算杀菌时间时将细菌指数递减因素考虑在内，将D值概念进一步扩大，提出了热力指数递减时间（TRT）概念。TRT定义就是在任何特定热力致死温度条件下将细菌或芽孢数减少到某一程度如10-n（即原来活菌数的1/10n）时所需要的热处理时间（分钟）。TRTn=nD即曲线横过n个对数循环时所需要的热处理时间。TRTn值与D值一样不受原始菌数的影响。TRT值的应用为运用概率说明细菌死亡情况建立了基础。如121℃温度杀菌时TRT12=12D，即经12D分钟杀菌后罐内致死率为D值的主要杀菌对象——芽孢数将降低到10-12。（5）仿热力致死时间曲线纵坐标为D对数值，横坐标为加热温度，加热温度与其对应的D对数值呈直线关系。110100100095100105110115120125加热温度(℃)D值(分钟)Z图3仿热力致死时间曲线若T2=121.1℃，则t2=F假定T1温度下的D值已知，则，t1=nD，则D、F、Z值之间的关系可以通过下式转换。或ZTTtt1221lgZTFnD11.121lgZTnFD/)1.121(110这样，已知T温度下的D值，Z值，再针对罐头产品需要确定n值后，就可计算得到相应的F值。n值并非固定不变，要根据工厂和食品的原始菌数或着污染菌的重要程度而定。比如在美国，对肉毒杆菌，要求n=12，对生芽梭状芽孢杆菌，n=5。[例2]在某杀菌条件下，在121.1℃用1min恰好将菌全部杀灭；现改用110℃、10min处理，问能否达到原定的杀菌目标？设Z=10℃。[例3.2解]已知：T1=110℃，t1=10min，T2=121.1℃，t2=1min，Z=10℃。利用TDT曲线方程，将110℃、10min转化成121.1℃下的时间t2′，则t2′=0.78min＜t2说明未能全部杀灭细菌。那么在110℃下需要多长时间才够呢？仍利用上式，得t1′=12.88min例3:某产品净重454g，含有D121.1℃=0.6min、Z=10℃的芽孢12个/g；若杀菌温度为110℃，要求效果为产品腐败率不超过0.1%。求：（1）理论上需要多少杀菌时间？（2）杀菌后若检验结果产品腐败率为1%，则实际原始菌数是多少？此时需要的杀菌时间为多少？例3解:（1）F0=D（lga–lgb）=0.6×(lg5448–lg0.001)=4.042minF110=F0lg-1[(121.1–110)/10]=52.1min（2）∵F0=0.6×(lga–lg0.01)=4.042min∴lga=lg0.01+4.042/0.6a=54480，即芽孢含量为120个/g。此时，F0=D(lga–lgb)=0.6×(lg54480–lg0.001)=4.642minF110=4.642lg-1[(121.1–110)/10]=59.8min例：有一发酵罐，内装培养基40m3，在121℃的温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢2×107个，在121℃时的灭菌速率常数为0.0287s-1。试求灭菌失败的机率为0.001所需的时间。解：(min)9.23ln1)(0287.0(001.0)(10810210400114760SSNNktskNN个）个例：有培养基30m3，在125℃的温度下进行6m3/h连续灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢105个，在125℃时的灭菌速率常数为11min-1。试求灭菌维持时间和维持罐体积。解：每分钟处理0.1m3有取停留8min301125608.081.0(min)24.3ln1)(m