PCR技术及其应用-1

PCR技术及其应用PCR技术原理5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目录Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+二、PCR体系基本组成成分三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C实验仪器电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽电泳技术（２）鉴定DNA分子量(3)胶回收纯化DNAlow-meltagarosePCR仪PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）凝胶成像系统PCR的类型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不对称PCR㈨差异显示PCR㈣共享引物PCR㈩重组PCR㈤锚定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR(十二)RAPD----------多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。基本概念增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。•在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。•多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。多重PCR巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物PCR技术应用•研究基因克隆，DNA测序，分析突变(制备杂交探针)–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•诊断遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,犯罪现场标本分析大肠杆菌胰岛素重组体+胰岛素基因基因工程产品×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFP分析法PCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。PCR-SSCP过程：---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳↓12345自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子.解链构像DAN原理过程DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物反转录PCR技术基因mRNA蛋白质多肽链逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon常规PCR方法的局限性分析：•无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析•必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒•无法对扩增反应实时检测三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时荧光定量PCR（real-timePCR）非特异性的嵌入荧光染料（Non-specificDNAbindingdyes）–SYBR®GreenI–SYBR®Gold–EthidiumBromideExtension5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaqRepeatDNAbindingdyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll实时PCR技术原理目录非特异性的嵌入荧光染料评价•优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜只需要设计PCR引物•缺点：由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况。TaqMan探针评价•优点：荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测可用于SNP的检测•缺点：比DNA结合染料价格高CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheory•Ct值（ThresholdCycle）PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。•模板起始浓度越高，Ct值越小•Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系•如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达•如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达CopyNumbervs.Ct-StandardCurvey=-3.3192x+39.772R2=0.9967051015202530354001234567891011Logofcopynumber(10n)Ct绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR技术的应用•目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：•1.DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。•2.基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证•3.基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。随着实时荧光定量PCR技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon原位PCR技术原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列原位PCR•Hasse等于1990年建立。•是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。•原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。•原位PCR的实验过程：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞玻片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。16块载玻片及24个0.2ml管的样品block操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达•组织处理有何要求：处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。•原位PCR的实验过程：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞玻片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。