PCR聚合酶链式反应剖析

第一章PCR技术原理定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:PCR概念的提出1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年获得诺贝尔奖引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段技术难点Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的发现1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)TaqDNA聚合酶优点1、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。PCR技术的基本原理和工作方式模板DNA95℃2.PCR工作方式PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增3.PCR基本材料①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+：DNA聚合酶的激活剂4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸25-35个循环5.PCR要素解析1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。5.PCR要素解析3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。5.PCR要素解析4）PCR反应液的配制顺序最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。5.PCR要素解析5）各种成分浓度作用：①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。③引物：1μM/L5.PCR要素解析④模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度72℃。PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。①长度：至少16bp，通常为18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性②引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3’端）。④G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3‘末端的重复排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC连排。5.PCR要素解析：引物设计6.PCR技术特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍•引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。•引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物6.PCR技术特点1）特异性3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。6.PCR技术特点4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学6.PCR技术特点1、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次实验所用材料PCR反应体系试剂体积（µl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto25PCR反应程序95℃5min1个循环95℃30sec35个循环60℃30sec72℃30sec72℃10min1个循环4℃hold琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中电荷效应琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中分子筛效应DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分浓度（%）线状DNA分子的有效范围（Kb）0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.1实验材料【材料】1.琼脂糖2.10mg/mlEB3.marker4.TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5MEDTA（pH8.0）100mlddH2Oto1000ml实验步骤【步骤】1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1×TAE）加热熔化。2、胶液冷却至60℃时，加入4μlEB，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入1×TAE，让液面高于胶面至少1mm。4、上样。5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80~100V），开始电泳。6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。琼脂糖凝胶电泳DNA回收实验原理离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐（盐酸胍，NaI,NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。试剂盒组成及储存方法名称用途溶胶/结合液DA溶胶（红色）结合液DD无色与DA混合后变为黄色洗涤液W1洗涤液去盐液W2洗脱盐离子（75%EtOH）洗脱液EB洗脱DNA吸附柱AC结合DNA收集管（2ml）收集废液实验步骤•切胶（1.5mL离心管）•加入500uL溶胶液DA（红色）•75℃水浴（约10min，期间颠倒混匀）•加入250uL结合液DD，颠倒混匀，颜色变为黄色•吸取上一步中的混合液转移到DNA制备管中。•12000g离心1min•离心完毕弃收集管中的滤液，加入500uLW1•12000g离心30s，弃滤液•加入700uLW2，12000g离心1min；•重复上一步骤•弃废液后，空管12000g离心1min•将制备管置于1.5mL离心管中，加30ul洗脱液EB到滤膜中央，室温静置1min•12000g离心1min注意事项切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30μl将降低洗脱效率。凝胶电泳检测