氢氧化钠用于层析介质及系统的清洗和消毒

GEHealthcare应用文献8-24-57AF工业层析氢氧化钠用于层析介质及系统的清洗和消毒氢氧化钠被广泛用于清洗、消毒和保存层析介质及层析系统。使用氢氧化钠的一大好处在于有效、低成本、并能容易检测、清除和处理。和其它的消毒剂一样，氢氧化钠的使用同样要注意采取一些措施，并对其与层析填料和层析系统之间的兼容性进行考察。本应用文献就氢氧化钠作为清洗和消毒剂的诸多方面进行检查。本文献收入了一些重组蛋白、单克隆抗体以及寡聚核苷酸生产者感兴趣的例子，因为在这些产品的商业生产中，设计和放大的清洗工艺验证是一个重要的问题()。清洗效率氢氧化钠一直被认为能有效去除蛋白和核酸。同时，它还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素。在实际的工业生产中为了节约时间，在氢氧化钠中加入氯化钠等盐物质，从而可将清洗和消毒两者进行结合。去除蛋白和核酸作为清洗剂，氢氧化钠能皂化脂肪并且可溶解蛋白(2)。总体来说，氢氧化钠可溶解沉淀的蛋白。氢氧化钠的水解作用可被氯增强(3)。氢氧化钠将蛋白和核酸从层析介质中去除的能力主要取决于介质本身性质、样品、以及干扰清洗效果的样品中的污染物性质。比如，如果脂类结合蛋白需要高浓度的氢氧化钠进行清洗。为了检验氢氧化钠清洗是否有效，使用者需要周期性的将储存液上样，并在每次清洗后运行空白梯度检测。(4)蛋白氢氧化钠被广泛用于清除结合在离子交换介质、疏水层析介质以及凝胶过滤介质中的蛋白。由于亲和层析介质大多数的固定配基稳定性不够，故以前氢氧化钠用于亲和层析时有一定的限制。如今，最新开发的新一代蛋白A亲和层析介质改变了这一事实。如MabSelectSuRe™纯化单克隆抗体的工艺中，MabSelectSuRe™与氢氧化钠的兼容性已经得到了明显的改善。MabSelectSuRe™是一种碱稳定的蛋白A配基，此介质的设计可以耐受0.-0.5M氢氧化钠溶液作为清洗剂。核酸核酸物质顽固地结合在阴离子交换介质上。然而，我们实验室的工作证实M氢氧化钠和3M氯化钠联合作用一小时可有效清除来自弱阴离子交换介质DEAESepharose™FastFlow上放射标记的小牛胸腺DNA。不过仍有小部分的DNA得以保留，这一部分在测试的所有条件下都未能得到清除。其他试验证实较低浓度或缩短接触时间会导致不能有效清除DEAESepharose™FastFlow上的核酸以恢复介质的分离能力。进一步的工作证实M氢氧化钠和M氯化钠联用能有效清除强阴离子交换介质QSepharoseFastFlow上的DNA，然而这种清除程度取决于样品的性质(5)。这些试验中在位清洗的接触时间为2小时。其中一个例子中采用了DNase对阴离子交换介质进行DNA彻底清除。病毒、细菌、酵母、真菌、朊病毒和内毒素的灭活病毒和朊病毒来自一个检测实验室的试验结果显示0.M的氢氧化钠足以使小鼠白血病病毒(一种典型包膜病毒)灭活(6)。最近，Q-OneBiotech公司公开了氢氧化钠对八种不同的病毒进行灭活的数据，该实验采用0.M和0.5M两个浓度的氢氧化钠进行研究，检测的病毒学活性见(表1)。值得注意的是，抵抗力较强的非包膜病毒，如犬细小病毒和SV-40也可用氢氧化钠进行灭活。并且，有关新型Creutzfeldt-Jakob病与疯牛病病毒(BSE)存在联系的报道更加引起人们对外来病原的重视。氢氧化钠可有效灭活BSE病细菌，酵母和真菌大量的微生物如酵母和细菌可破坏层析柱和介质的功能。它们还具有一些间接影响如阻塞过滤层和其他系统元件。此外，它们还可产生一些有害物质如内毒素肠毒素和蛋白酶。表2显示了氢氧化钠对于灭活大量酵母和细菌方面非常有效，灭活效果取决于浓度、接触时间和温度。表2中也清楚的显示细菌孢子并不能彻底地被氢氧化钠灭活。然而，药品生产质量管理规范(GMP)和严格的卫生措施可杜绝生产环境滋生细菌污染。一些人推荐采用过氧乙酸(peraceyicacid)作为层析过程有效灭菌和消毒的制剂(9)。虽然过氧乙酸确是一个有效的消毒剂，但层析系统暴露于此试剂剂下可能会改变层析介质的功能，并泄漏的物质掺入终产品中。毒，这一病毒对大多数的处理手段都具有相当的抵抗，包括360℃干烤一小时处理(7，8)。表1.用0.M和0.5M氢氧化钠对8种不同病毒*进行灭活。斜体标示的值表明样品中未检测到病毒，列出值为理论最小检测滴度。†HIVBVDVCPVBHVPOLSV-40MLVADV0.MNaOHSpike2.0×069.5×062.0×096.9×097.×08.7×082.6×052.2×08t=0min5.9×1022.7×07.9×03.2×023.5×04.5×053.7×101.7×02t=0min5.7×1022.7×052.4×03.5×02.7×033.6×053.8×1016.0×0t=20min5.8×102.5×049.6×024.5×02.0×044.7×044.0×1016.3×0t=60min5.8×1022.7×045.0×034.5×02.×032.0×044.3×1012.9×0Inactivation(log0)3.52.55.68.25.53.93.86.90.5MNaOHSpike2.0×069.5×062.0×096.9×097.×08.7×082.6×052.2×08t=0min5.7×102.9×049.4×025.9×101.×05.5×056.3×1019.4×0t=0min5.6×102.3×02.2×035.9×101.×05.7×034.7×1017.5×0t=20min5.6×1021.7×102.5×035.9×1012.0×048.4×034.7×1012.0×0t=60min6.7×1021.7×102.5×035.9×1016.2×03.0×025.5×1012.2×0Inactivation(log0)3.54.76.8.5.6.23.77.0病毒滴度*HIV:人免疫缺陷病毒型;BVDV:牛病毒性腹泻病毒;CPV:犬细小病毒;BHV:牛疱疹病毒1型;POL:人脊髓灰质炎病毒2型;SV-40:猿猴病毒40;MLV:小鼠白血病病毒;ADV:人腺病毒2型。数据来自苏格兰科学园西侧GlasgowG200XA,Q-OneBiotechLtd.,Todd大学。†除BHV和MLV(用空斑形成单位pfu表示)，其他病毒的病毒滴度均用TCID50表示(tissuecultureinfectivedose)。24表2氢氧化钠灭活微生物A)所有检测的微生物类型以及美国培养细胞库(ATCC)号大肠杆菌8739gram–菌金黄色葡萄球菌6538gram+菌铜绿假单胞菌9027gram–菌枯草芽孢杆菌6633芽孢细菌白色念球菌023酵母黑曲霉孢子菌6404霉菌微生物ATCC号类型B)不同时间和不同温度下检测结果大肠杆菌0.02h4或22金黄色葡萄球菌0.h4或22白色念球菌0.5h4或22黑曲霉孢子菌0.5h4或22枯草芽孢杆菌.048h222枯草芽孢杆菌.08d34绿脓杆菌0.5h22微生物NaOH(M)时间温度.(℃)减少至检测限以下3微生物/ml2减少至检测限以下0个微生物/ml3减少至检测限以下00个微生物/ml为了增加对抗药微生物如草芽孢杆菌的效率，加入乙醇以增强氢氧化钠的抗菌作用。表3显示将20%乙醇添加入0.M和0.5M氢氧化钠后增加的抗菌效果。微生物挑战实验被开展用于不断更新设计满足清洁需要的系统和层析柱。ÄKTAprocess™是一种自动化的层析系统，被用于工艺放大和大规模生物药物生产(0)。ÄKTAprocess系统拥有很多特色，使1M氢氧化钠清洁变得简表3.氢氧化钠添加20%乙醇对枯草芽孢杆菌的除菌效果(log0减少)单而有效。对于另一个用于工艺开发、放大和缩小以及小规模生产使用的ÄKTApilot™系统，其清洁过程同样可用1M氢氧化钠进行处理。消毒步骤显示了良好的效果，对测试的4种微生物至少可06减少克隆形成单位()。同样，我们发现氢氧化钠对与BPG™(2)和Chromaflow™(3)柱在位清洁同样有效。将这些层析柱暴露于不同的微生物，然后用氢氧化钠进行特定的CIP程序证明可进行有效清除。内毒素图显示了氢氧化钠对于溶液中大量内毒素进行灭活的效果。需要注意的是相对于浓度为0.5M和M的氢氧化钠采用0.M氢氧化钠时需要更长的接触时间。内毒素挑战实验在BioProcess™系统上进行，该系统连接BPG柱，柱内填充QSepharoseFastFlow介质。该系统和填充柱用每毫升含200EU内毒素的溶液充满，在室温下保持23h。然后用M氢氧化钠循环清洗小时以除去致热原之后，用不含内毒素物的灭菌水进行清洗，最后用LAL实验和总有机碳(TOC)等方法进行检测。TOC分析被用于检测残留在系统中不含碳的失活内毒素片段。将柱子的填料倒出，搅拌，对QSepharoseFastFlow介质进行LAL检测。结果表明即使在大量致热原存在下，M氢氧化钠处理小时后，可对系统进行致热原清除(2)。非常重要的一点是每个物料都是唯一的，而其他的物料物质如脂质和蛋白具有一定的保护效果。我们推荐内毒素检测作为除热原有效性的常规评价部分。––gol7gol3h42gol4gol2––h003抗菌处理时间0.5MNaOH0.5MNaOH和20%乙醇0.1MNaOH0.1MNaOH和20%乙醇024682022500.302030405060708090000.MNaOH0.5MNaOH.0MNaOH内毒素(ng/ml)图1.氢氧化钠灭活内毒素(来自GEHealthcare)氢氧化钠的其他用途氢氧化钠和其他消毒剂相比价格相对便宜。作为一种抑菌剂，氢氧化钠也被推荐作为介质储存液。根据PDA生物技术清洁认证委员会(3)的报导，0.至.0M的氢氧化钠通常可用来保存的层析柱。通过简单的在线PH和电导测定可判断氢氧化钠是否去除干净。而且，处理氢氧化钠相对容易，不需要特殊的手段。注意必须注意层析介质、层析柱、系统以及辅助部件是否和使用的氢氧化钠浓度、时间以及在何温度下的兼容性。还需注意的是氢氧化钠对金属和皮肤具有一定的腐蚀作用(2)。兼容性用于CIP和消毒的氢氧化钠浓度主要取决于污染的程度。对于层析介质而言，是否支持严格的消毒条件取决于功能基团成份，吸附化学物质以及基质等在碱性环境下的稳定性。稳定性方面的研究非常多，在大量文献中都有记载(3-8)。表4(第6页)列举了在不同PH下一定范围的介质通常的稳定性。表5显示了ButylSepharose4FastFlow在M氢氧化钠作用下的功能稳定性。将介质在室温条件下保存氢氧化钠中，4周后对四种不同标准蛋白洗脱的保留时间无明显差异。表5.ButylSepharose4FastFlow在M氢氧化钠CIP处理后的功能稳定性(摘自参考文献7)ABCD56.504.7308.3205.8084.53.7380.3204.8374.548.6362.3244.84PooledS.D.(n=9)0.20.360.70.08室温下保存与1MNaOH中的星期数滞留时间minA：细胞色素CB：核糖核酸酶AC：溶菌酶D：糜蛋白酶原26亲和配基通常比较脆弱，不能耐受过于剧烈的环境，因此需要减少使用的氢氧化钠浓度。尽管如此，近来新一代的亲和填料在性能上已经得到了明显的改善。MabSelect™是一种重组蛋白A亲和介质，被用于工业上单克隆抗体的生产(如高流率下进行大体积样品处理)。测试Mab