生物化学实验

生物化学实验一、糖的颜色反应及还原作用实验一：糖的颜色反应实验1.1莫氏实验一、目的掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。二、原理糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应”，其反应如下图：利用这一性质可以鉴定糖。三、实验器材1、棉花或滤纸。2、吸管1.0ml(*4)、2.0ml(*1)。3、试管1.5*15cm(*4)。四、实验试剂1、莫氏试剂：称取α-萘酚5g，溶于95%乙醇并稀释至100ml。此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。2、1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml.4、1%淀粉溶液：讲1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。最后以沸蒸馏水稀释至100ml。五、操作于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中）。然后各加莫氏试剂2滴1，摇匀，讲试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。六、注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫酸加入的方式应保持一致。2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。思考题：1、解释α-苯酚反应的原理。2、用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？试验1.2塞氏试验一、目的掌握塞氏（Seliwanoff）实验鉴定酮糖的原理和方法。二、原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生产5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应，有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鲜红色沉淀2，以果糖为例，其反应如下：三、实验器材1、吸管0.5ml(*3)、5.0ml(*1)。2、试管1.5cm*15cm（*3）。3、水浴锅。四、实验试剂1、塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100ml盐酸中[V(H2O):V(HCl)=2:1],临用时配制。2、1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。3、1%葡萄糖溶液：见实验1.1。4、1%蔗糖溶液：见实验1.1。五、操作于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%果糖溶液各0.5ml。各加塞氏试剂2.5ml，摇匀。同时至沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。六、注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水锅内。2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。思考题1、在塞氏实验中，反应产生的沉淀为何能够溶于乙醇溶液并产生鲜红色？2、蔗糖为何有塞氏反应？实验1.3杜氏实验一、目的掌握杜氏（Tollen）实验鉴定戊糖的原理和方法。二、原理戊糖在浓硫酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本实验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖的特有反应。果糖、半乳糖和糠醛等都是呈阳性反应、戊糖反应最快，通常在45s内即产生樱桃红色沉淀。三、实验器材1、吸管1.0ml(*3)2、试管1.5cm*15cm(*3)3、水浴锅四、实验试剂1、杜氏试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml，缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml即得，临时用配制。2、1%阿拉伯糖溶液：称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。3、1%葡萄糖溶液，见实验1.1。4、1%半乳糖溶液：称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。五、操作于三支试管中加入杜氏试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，摇匀。将试管同时加入沸水浴中，观察颜色变化，并记录颜色变化的时间。六．注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水浴锅中。2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。思考题1、在Tollen反应分析位置样品时，应注意些什么问题？2、列表总结和比较本实验三种颜色反应的原理及其应用。二、多糖的性质多糖的实验一、目的1、熟悉淀粉多糖的碘实验反应原理和方法。2、进一步了解淀粉的水解过程。二、原理淀粉分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶于或难溶于水的的性质来制备淀粉。淀粉遇碘呈蓝色1，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖大多数能与碘呈特异的颜色，此类呈颜色物质也不稳定。淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖、最后水解成葡萄糖，（C6H10O5）（C4H10O5）C17H22O11C4H12O4淀粉各种糊精麦芽糖葡萄糖淀粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。三、实验器材1、马铃薯3、布氏漏斗（*1）、抽滤瓶500ml（*1）2、纱布、研钵（*1）4、表面皿10cm（*1）、白瓷板、皮头滴管5、试管1.5cm*15cm(*4)8、量筒25ml（*1）6、电炉、石棉网9、吸管1.0ml(*1)7、烧杯50ml（*1）10、木质试管四、实验试剂1、稀释液：配制2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡棕黄色即可。2、0.1%淀粉：称取淀粉1g，加少量水，调匀，倾入沸水，边加边搅，并以热水稀释至1000ml，可加数滴甲苯防腐。3、10%NaOH溶液:称取NaOH10g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。4、本尼迪特试剂：见实验2.5、20%硫酸（V/V）：量取蒸馏水78ml置烧杯中，加入浓硫酸20ml（相对密度1.84）.摇匀，冷却后贮于试剂瓶中。6、10%碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠10g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。五、操作1、马铃薯淀粉的制备讲生马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气中干燥即得。2、淀粉与碘的反应（1）置少量自制淀粉于白瓷板上，加1至3滴稀碘液，观察颜色变化。（2）取试管1支，加0.1%淀粉液5ml，再加2滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。将管内液体分成3分，其中1分加热，观察颜色是否褪去。冷却后，颜色是否全部恢复。另2份分别加入乙醇或10%NaOH溶液，观察颜色变化并解释之。3、淀粉的水解在一小烧杯内加入1%淀粉溶液25ml及20%硫酸1ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔2min取出反应2滴置于白瓷板上做碘试验。与此同时另取反应液3滴，用10%碳酸钠溶液中和后，做本尼迪特试验（参阅试验2），记录试验结果并解释之。六、注意事项1、淀粉提取时可适当加热以促进淀粉聚沉，但温度不能超过50℃，否则会因溶解度增大而减少产量。2、用水洗涤淀粉时需待淀粉沉降完全后再小心倾出上清液，亦可直接用滴管吸去上清液。思考题淀粉有没有还原性？如何验证？三、植物组织中可溶性总糖的测定一、目的掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。二、原理糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟基糠醛，糠醛或羟基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在60nm处有最大吸收。在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。蒽酮法几乎可以测定所有的糖类物质，不但可以测定戊糖于己糖，而且可以测定寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素、糖原等（因为反应液中的浓硫酸可以将多糖水解成单糖而发成反应），所以用蒽酮法测出的糖含量，实际上是溶液中的总糖含量。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。三、实验器材1、新鲜植物叶片5、水浴锅、电炉2、吸管1.0ml（*2）、5ml（*1）、0.1ml6、电子分析天平（*1）、0.2ml(*1)、0.5ml(*3).7、容量瓶100ml（*1）、玻璃漏斗。3、试管1.5cm*15cm(*7)8、量筒、研钵、三角烧杯4、紫外可见分光光度计。四、实验试剂1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml80%（V/V）的硫酸中，当日配制使用。2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100ml葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）五、操作1、制作标准曲线取干净试管6支，按表6进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作为图得标准曲线。表6蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作管号试剂012345标准葡萄糖溶液/ml00.10.20.30.40.5蒸馏水/ml1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min蒽酮试剂4.04.04.04.04.04.0沸水浴中准确煮沸10min，取出，用自来水冷却，室温放置10min，在620nm处比色。A620nm3、可溶性糖的提取和测定取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎、加入3ml蒸馏水，在年播种磨成匀浆，转入锥形瓶，并用12ml蒸馏水冲洗研钵2至3次，洗出液也转入锥形瓶中。用塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，冷却后过滤并定容至100ml，此为待测液，吸取待测液0.5ml于试管中，加蒸馏水0.5ml，浸于冰水浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值有标准曲线查算出样品液的糖含量。六、计算（总糖）=[(C*V)/m]*100%式中（总糖）：总糖的质量分数（%）；C:从标准曲线上查出的糖含量（mg/ml）;V:样品稀释后的体积（ml）m:样品的质量（mg）七、注意事项1、若提取物中过多色素会干扰显色，须事先除去。2、参见实验8注意事项。思考题1、本实验蒽酮法用于测定植物叶片的可溶性糖，非可溶性糖可用此方法除去吗？2、制作标准曲线时应注意哪些问题？三、蒽酮-硫酸比色定糖法一、目的掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。二、原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离得的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应溶液呈蓝绿色，在620nm出有最大吸收。蒽酮可与其他一些糖类发生反应，单显现的颜色不同，当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色，对于以上特定的糖类，反应较稳定。本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。三、实验器材1、无蛋白滤液或其他材料4、紫外可见光光度计2、吸管1.0ml（*2）、5ml（*1）、0.1ml5、水浴锅（*1）、0.2ml(*1)、0.5ml(*3).6、电炉3、试管1.5cm*15cm(*7)7、电子分析天平。四、实验试剂1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml体积分数为80%(V/V)的硫酸中，当日配制使用。2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml），100mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作为防腐剂）。3、标准唐宇溶液（0.1mg/ml）:100mg糖原溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作为防腐剂）。五、操作1、创作标准曲线取干净试管6支，按表5进行操作。表5蒽酮比色法定糖——标准曲线的创作管号试剂012345标准葡萄糖溶液/ml00.10.20.30.40.5蒸馏水/ml1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min蒽酮试剂4.04.04.04.04.04.0沸水浴中准确煮沸10min，取出，用自来水冷却，室温放置10min，在620nm处比色。A620nm以吸光度为纵坐标，各种标准浓度（mg/ml）为横坐标做图得标准曲线。3、样品含糖量测定吸去1ml无蛋白糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出用哪个自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光光度值由标准曲线查算查出样品液的糖含量。四、计算=[CV/m]*100%式中，糖的质量分数（%）C:从标准曲线上查出的糖质量浓度（mg/ml）V:样品稀释后的体积m:样品的质量五、注意事项1、蒽酮试剂中硫酸的