甘露聚糖酶活测定

溶液溶菌酶混合液：2mg/mL溶菌酶、50µg/mLRNase、0.3mol/L蔗糖、25mmol/LTris-HCI（PH8.0）、25mmol/LEDTA（PH8.0）；氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100ml。乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。0.5%魔芋精粉底物：称取0.5g魔芋精粉加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至魔芋精粉完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。DNS试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，溶于500mL蒸馏水，水浴至45℃，搅拌，然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液澄清透明（加入氢氧化钠过程中温度不要超过48℃），再逐步加入酒石酸钾钠91g，苯酚2.5g，亚硫酸钠2.5g，维持45℃，同时补水300mL，不断搅拌直到完全溶解。冷却后，定容至1000mL。避光保存，静置一周，待用。10×微量元素溶液（PTMl）：CuSO4·5H2O6g/L,，NaI0.08g/L，MnSO4·H2O3g/L，NaMnO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.2g/L，ZnCl220g/L，CoCl20.5g/L，FeSO4·7H2O65g/L，生物素0.2g/L，浓硫酸2mL/L。过滤除菌，保存于4℃，用于补加到基础盐培养基和其它补料成分之中。基础培养基添加量为4.8‰，补料使用时添加量为12‰。染色液：考马斯亮兰R-2502.5g，甲醇454mL，冰醋酸92mL，水454mL。脱色液：甲醇456mL，冰醋酸72mL，水472mL。酶活测定（参照国际标准）2.2.10.1甘露聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（SigmaG0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。2.2.10.2测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。2.2.10.3标准曲线的绘制吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/mlD-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。2.2.10.4试样溶液的制备粗酶液直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行稀释、定容（稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节、校正至5.5，然后再用缓冲溶液做适当定容。2.2.10.5测定步骤(1)将上述稀释后的酶液和0.5%魔芋精粉底物分别放入50℃水浴锅，平衡10min。(2)吸取2.00ml稀释后的酶液，加入到25mL比色管中，再加入5mlDNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液，50℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。(3)吸取2.0ml经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液，电磁振荡3s，50℃精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂，电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。2.2.10.6酶活的计算利用一下公式对酶活力进行计算：[（AE-AB）×K+CO]XD=×1000（1）M×t式（1）中：XD—试样稀释液中的甘露糖聚酶活，u/ml；AE—酶反应液的吸光度；AB—酶空白样的吸光度；K—标准曲线的斜率；CO—标准曲线的截距；M—甘露糖的分子量（180.2）；t—酶解反应时间，min；1000—转化因子，1mmol=1000umol。XD值应在0.04-0.08u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XD·Df（2）式（2）中：X—试样甘露聚糖酶的酶活，U/mL；Df—试样的总稀释倍数。酶活的计算值保留三位有效数字。分别用2mL浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mg/mlD-甘露糖标准溶液和5mlDNS试剂沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值（表4-1）。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线（图4-4）。表4-1标准曲线的绘制Table.4-1thenormalcurvepictureD-甘露糖浓度（mg/mL）0（CK）0.100.200.300.400.500.600.70OD54010.01420.03340.15680.28300.38920.52060.64620.755920.01410.03340.15680.28300.38930.52060.64620.755830.01430.03350.15680.28310.38930.52060.64630.7558平均值0.01420.03340.15680.28300.38930.52060.64630.7558重组酵母酶活测定重组酵母Man和syn-Man分别进行100mL摇瓶产酶发酵，每12h添加甲醇至终浓度为1﹪，每24小时取粗酶液测一次酶活。结果如下表4-2：表4-2不同发酵时间段酶活力的测定Table.4-2EnzymeactivityexpressingManandsyn-Manatdifferentfermentationtime.发酵时间24h48h72h96h120h酶活力（U/mL）Man15.3720.4136.6351.8193.28syn-Man54.8970.14344.22379.42479.01