2nd-CRIPR-Cas9-targeted-genome-editing

CRISPR/Cas9Targetedgenomeediting2014.11.01Targetedgenomeediting1CRISPR/Cas概述2CRISPR/Cas9引入动植物3CRISPR/Cas9应用举例4TALENvsCRISPR/Cas95CRISPR/Cas9的改造CONTENTS1CRISPR/Cas概述1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。2013以后，研究者们在包括《science》《nature》《naturebiotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼及拟南芥、水稻等物种上实现精确的基因修饰。CRISPR/Cas系统•CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。•CRISPR/Cas系统是细菌针对噬菌体等外源基因的获得性免疫系统。CRISPR——Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(规律成簇的间隔短回文重复)。CRISPR/Cas——CRISPR-associated。CRISPR位点通常由短的高度保守的不连续的同向重复和及其间隔着的大小与之相近的非重复间区序列（spacer）组成。重复序列的长度通常21~48bp,重复序列之间被26~72bp的spacer隔开。CRISPR就是通过这些spacer与靶基因进行识别。CRISPR-Cas主要由两部分组成：识别切割1.1CRISPR/Cas主要结构Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。1.2CRISPR/Cas系统分类根据保守性的Cas蛋白之间的进化关系及Cas基因操纵子的组成方式准可以将CRISPR/Cas系统分为：•TypeⅠ：Cas蛋白最多最复杂，包含6个蛋白，其中有特征性的Cas3蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能。→→CASCAD•TypeⅡ：Cas9蛋白（分子量大，RuvC&HNH）、tracrRNA&crRNA（改造sgRNA）。→→核糖核蛋白复合体•TypeⅢ：特征性的Cas10蛋白。类似于TypeⅠ。→→CASCAD1.2CRISPR/Cas系统分类•CRISPR-Cas系统识别靶序列的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）为NGG。在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGGPAM。1.3CRISPR/Cas9的发现及作用机制第一步：CRISPR的高度可变的间隔区的获取1.3CRISPR/Cas9的发现及作用机制第一步：CRISPR的高度可变的间隔区的获取protospaceradjacentmotifprotospacer1.3CRISPR/Cas9的发现及作用机制第二步：CRISPR基因座的表达1.3CRISPR/Cas9的发现及作用机制第三步：CRISPR-Cas系统活性的发挥1.3CRISPR/Cas9的发现及作用机制第三步：CRISPR-Cas系统活性的发挥1.3CRISPR/Cas9的发现及作用机制核糖核蛋白复合体入侵的外源DNAPAMCas9蛋白crRNAtracrRNAGenomicDNA1.3CRISPR/Cas9作用机制1.3CRISPR/Cas9作用机制•DSB（double-strandbreaks）DNA双链进行切割之后会形成DNA双链断裂缺口。•HDR(homology-directedrepair)同源重组修复机制——以同源链为模板，对DSB进行修复。由于这种修复作用是以同源链为模板，而且还有位点特异性的核酸酶参与，所以其保真度非常高。利用HDR可以插入一个或者多个基因，也可以进行单碱基替换。•NHEJ(nonhomologousendjoining)非同源末端连接修复机制——没有同源模板链，直接修复。容易出现小的插入或者缺失突变InDel(insertion-deletion)，是非保真的修复机制，常常会导致移码突变，破坏基因功能。细胞DNA双链断裂重组修复机制knockinknockout1.3CRISPR/Cas9作用机制CRISPR-CasRGNseg：CRISPR/CascrRNA与tracrRNA形成的双链RNA指导的Cas9蛋白靶位点切割trans-activatingcrRNAcrRNA与tracrRNA形成的sgRNA指导的Cas9蛋白靶位点切割sgRNA：singleguideRNAsgRNA比crRNA更具优势（效率高、简便）2CRISPR/Cas9引入动植物•Cas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9蛋白的C端或是N端加上真核细胞的核定位信号（NLS）。•NLS(Nuclearlocalizationsequence/signal)蛋白质的一个结构域，通常为一短的特异的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能通过核孔被运进细胞核。a.Zhang等指出在Cas9蛋白的两端各加一个NLS；b.Mail等只需在Cas9蛋白的C端加上NLS；c.Shen等认为只有在C端添加NLS并且在NLS和Cas9蛋白之间加上32个氨基酸残基的接头才能发挥功能。2CRISPR/Cas9引入动植物U6promoterLBRBCas9KanNospolyAoribomBglⅡNLSNLS携Cas9基因的质粒3CRISPR/Cas9应用举例动物：小鼠奶牛…•人•植物：拟南芥水稻小麦…通过CRISPR/Cas9对小鼠癌细胞突变研究人员还利用CRISPR构建出了携带β-catenin癌基因的小鼠模型，这一基因可使得细胞在随后发生其他的突变时更有可能癌变。为了构建这一模型，研究人员必须删除β-catenin基因正常版本，并用过度激活的形式替代它。他们在0.5%肝细胞中取得了成功。3.1通过CRISPR/Cas9对小鼠癌细胞突变P53和Pten是小鼠体内可以通过调控细胞生长来保护细胞免于癌变。利用Cas酶靶向切割P53和Pten的基因片段，研究人员在3%的肝细胞中破坏了这两个基因，使得小鼠3个月内生成了肝肿瘤。通过CRISPR/Cas9文库对人类细胞功能基因组的高通量筛选3.2CRISPR/Cas9与人Lentiviral-deliveredsgRNAcreatesindelswithhighefficiencyinhumancellsstablyexpressingCas9andOCT1Structureofthelentiviralplasmidexpressing2A-linkedOCT1andCas9SchematicdiagramofthesgRNAexpressionconstructinalentiviralbackbone•RelativeexpressionlevelofCas9byreal-timePCR.•Indelsinducedbylentivirus-deliveredsgRNASchematicofsgRNAlibraryconstructionandfunctionalscreeningScreeningforessentialgenesforPA/LFnDTAanddiphtheriatoxin(DT)toxicity.ScreeningforessentialgenesforPA/LFnDTAanddiphtheriatoxin(DT)toxicity.Geneticvalidationofcandidategenes3.3CRISPR/Cas9在植物中的应用•Targetedgenes：•Breadwheat(TriticumaestivumL.,2n=42,AABBDD)TaMLO-A1,TaMLO-B1andTaMLOD1CRISPR/Cas9&TALENinBreadwhea(tresistancetopowderymildew)PAM•ThecodingsequencesofthetwonucleasemonomersareexpressedfromthemaizeUbiquitin1promoterandseparatedbyaT2AtranslationalskippingsequencePCR-REassayTALEN-inducedmutantTaMLOallelesidentifiedbysequencing15representativetransgenicwheatplantsMolecularandgeneticanalysisofTALEN-inducedmutationsinTaMLOhomoeologsandtheirtransmissiontotheT1generationSequencesofT-MLO-inducedmutationsinthethreeMLOhomoeoallelesintheprotoplastsLossofTaMLOfunctionconfersresistanceofbreadwheattopowderymildewdisease•PercentageofmicrocoloniesformedfromthetotalnumberofgerminatedsporesofBlumeriagraminisf.sp.tritici(Bgt)inoculatedontheleaves•MicrographsofmicrocolonyformationofBgtonthesurfacesofleavesLossofTaMLOfunctionconfersresistanceofbreadwheattopowderymildewdiseaseConclusions•TALENsandtheCRISPR/Cas9systemcanbeusedtogeneratebeneficialgenetictraitsinhexaploidbreadwheat。•TheNHEJpathwayenablestargetedDNAinsertion。•Provideamethodologicalframeworktoimprovepolyploidcrops。OtherConclusions•Thevariationinmutagenesisefficiency（诱变效率）amongdifferentgenesmaystemfromdistinctsgRNAbindingstrengthtoindividualtargetsequencesordistinctchromatinstructureandepigenetic（表观遗传）state.•Thedifferentgenomemutagenesisfrequenciesandpatternsinplantsareduetodistinctplantgenotypesorphysiologicalstatesrequiresfutureinvestigation.•thesgRNA:pcoCas9systemcouldfacilitate（促进）multiplexgenomeeditinginplants.•TargetedgenewithmultiplesgRNAscouldimprovethesuccessrateoftargetedmutagenesis（突变形成）andg