干细胞鉴定

干细胞鉴定QualityAssuranceDept.JaneChenOricellTM检测项目•常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测；内毒素检测；•鉴定检测：生长形态、增殖能力、诱导分化能力、特异性抗原表达、核型分析等常规检测项目检测方法检测对象检测标准细菌、真菌检测直接接种培养法培养上清液阴性支原体检测直接接种培养法培养上清液阴性PCR法细胞阴性内毒素检测凝胶法培养上清液≤50EU鉴定检测共通项目•复苏存活率：台盼蓝拒染法--如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。•细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或MTT法）细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区间进行。可在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。GrowthCurve01020304050601234567DayCellquantity（1X104）•细胞周期测定：碘化丙锭(PI)染色流式检测法由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，可通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测，由此可知细胞周期的分布情况并确知细胞的倍体是否正常。•生长增殖要求细胞类别复苏存活率增殖速度细胞密度(个/cm2）间质干细胞≥80%按1:3分种率，2～3天可传代人：1.5~2.5X104大鼠：6x103小鼠：8x103兔：2~3x104狗：1.5~2.5X104小鼠胚胎干细胞≥70%按1:6分种率，2～3天可传代5~10X104人胚胎干细胞≥10%按1:6分种率，5～7天可传代1~5X104大、小鼠神经干细胞≥50%按1:6分种率，3～4天可传代1.5X105间质干细胞•定义：来源于中胚层的早期细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，能够分化为多种中胚层和神经外胚层来源的细胞。•来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。•来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、猪等。鉴定方法•形态学：梭型、纤维样贴壁细胞•表面抗原：MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性,它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括:①黏附分子,如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体,如白介素21受体(IL-1R)、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、C干扰素受体(IFN-CR)、肿瘤坏死因子(TNF)-A等。③整合素家族成员,包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其他如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等,也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子及主要组织相容性复合物类分子如HLA-DR抗原等。•多向分化能力：如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、平滑肌细胞、骨髓基质细胞、成纤维细胞及多种血管内皮细胞，甚至神经系统的神经元和神经胶质细胞梭形、纤维样细胞原代：克隆样生长传代后：均质、旋涡状排列HumanDogMonkeyMouseRatRabbit形态学表面抗原（流式鉴定）名称CD14CD45CD44CD29CD105检验标准≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%结论阴性阴性阳性阳性阳性1.人骨髓间质干细胞2.小鼠骨髓间质干细胞名称CD117CD34CD44CD29Sca-1检验标准≤5%≥70%≥70%≥70%≥70%结论阴性阳性阳性阳性阳性名称CD34CD45CD11bCD44CD29CD90检验标准≤5%≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%结论阴性阴性阴性阳性阳性阳性3.大鼠骨髓间质干细胞4.大鼠脂肪间质干细胞名称CD34CD45CD11bCD106CD44CD29CD90检验标准≤5%≤5%≤5%≤5%≥70%≥70%≥70%结论阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性诱导分化能力•成骨：茜素红染色•成脂：油红O染色•成软骨：阿利辛蓝/甲苯胺蓝染色成骨诱导•诱导原理：地塞米松：通过促进CbfalmRNA（核心结合因子-1）和OsterixmRNA（成骨分化必需转录因子）的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。β-甘油磷酸钠：提供磷离子作为ALP作用的底物，诱导和激活ALP，促进有机磷向无机磷转化，为钙盐矿化沉积提供条件。Vc：一种重要的营养素和氧化还原剂，在骨盐代谢及骨形成中具有重要作用。在体外，它能增加钙盐的沉积，促进矿化结节的形成。成骨诱导检测方法茜素红染色碱性磷酸酶染色成骨诱导过程中钙离子以钙盐的方式沉淀下来，形成“钙结节”，茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外沉积的钙结节也就被染成深红色。碱性磷酸酶活性是成骨细胞分化成熟的重要标志。BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在其催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。VonKossa染色I型胶原检测确定细胞外基质矿化的方法，只有成骨细胞在体外培养时能形成矿化的细胞外基质，一般培养至6~8周即可出现。原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。成骨细胞可合成I型胶原，是成熟成骨细胞的标识物之一，免疫荧光法检测其表达在骨细胞核周围。各种属MSCs成骨诱导茜素红染色效果HumanRatMouseRabbit成脂诱导•诱导原理间质干细胞在IBMX、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛等诱导下可向脂肪组织分化。分化的细胞可表达过氧化物酶体增殖激活的受体－2（PPAR-2）、脂蛋白脂酶和脂肪酶结合蛋白Ap2，且在细胞内出现富集的脂质小泡。成脂诱导检测方法•油红O染色成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。OilRedO染色的方法是对油滴的染色的一种方法。各种属MSCs成脂诱导油红O染色效果HumanRatMouseRabbit成软骨诱导•诱导原理TGF-β可促进软骨细胞基质的合成代谢，诱导间质细胞形成软骨前增加软骨前体细胞的凝聚，使软骨的形成增加，促进软骨基质的合成、分泌。但它的诱导作用与剂量相关，且与地塞米松、维生素C有协同作用，从而对软骨的生长代谢起调控作用。成软骨诱导方法三维培养法：能容纳高密度的细胞（与胚胎体内软骨发育的过程类似），细胞外基质也可良好地固定在细胞附近，细胞之间的粘附、增殖，有利于细胞间信号传导，为维护细胞的代谢活动提供适宜的微环境。可以说，在离心管三维培养法中细胞外基质对细胞增殖分化及代谢的调节作用得到了充分地发挥，是构建组织块的良好方法。但后续需做石蜡切片后方可进行染色鉴定，较为繁琐。贴壁诱导：后续检测较为简便，但不适用于增殖过快或贴壁性较差的细胞。成软骨诱导检测方法甲苯胺蓝染色：检测蛋白多糖（软骨细胞特异分泌的基质成分）的分泌；是一种异染染料，可将蛋白多糖类（粘液）染成紫红色，而其余组织呈不同程度的蓝色阿利辛蓝染色：检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,可使软骨中硫酸软骨素、硫酸胶质素等主要成分呈现蓝色，阿利新蓝的软骨染色常与染液的pH（大约为2.5左右）有关II型胶原检测：软骨细胞合成的特异性成分，通过免疫组化的方法可以观察细胞II型胶原的表达情况。各种属MSCs成软骨诱导阿利辛蓝染色效果F344SDRabbitC57胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonicstemcell-ES)是指囊胚期的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、具有发育全能性的早期胚胎细胞无限增殖、自我更新可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型•形态学：集落样或克隆样生长•特异性转录因子/抗原表达：表达OCT-4，Nanog；SSEA种属间表达有差异•染色体结构：传代过程中保持正常稳定的核型•全能性：具有向胚胎的3个胚层来源的所有细胞分化的能力鉴定方法形态学鼠ES：紧密牢固结合、多层密集立体生长，呈堆积状，边缘清楚，细胞核大、核仁明显、核浆比高。人ES：相对松散、扁平状集落,集落内细胞界限隐约可见特异性表达抗原Oct-4NanogSSEA-1SSEA-3SSEA-4人ES++—++鼠ES+++——抗原人ES/EC人EG猕猴ES鼠ES/EC/EG马ES猪EG鸡EG鱼ESSSEA-1—+—+++++SSEA-3++——————SSEA-4+++—————碱性磷酸酶染色染色体结构•核型分析：正常稳定的二倍体核型。•不随传代次数而改变。•人（46，XX/XY），鼠（40，XX/XY)人ES核型分析：46，XX鼠ES核型分析：40，XY全能性•体内：畸胎瘤实验•体外：去除饲养层细胞拟胚体（EB,embryoidbody。为ES细胞悬浮生长自发分化形成，含有内中外三个胚层组织，能模拟体内的发育过程)贴壁诱导特定条件诱导/自然分化（除去LIF）各胚层特定抗体免疫组化检测体内分化畸胎瘤将细胞注射入（约106个）SCID（重症联合免疫缺陷）或裸鼠体内，约4周后（人ES可能需要8~10周），可见细胞注射处有肿块生成，处死小鼠，肿瘤固定后做石蜡包埋，切片，普通HE染色后观察。ES可在小鼠体内生长、分化、形成含有三个胚层来源的良性畸胎瘤。外胚层：鳞状上皮、神经组织等中胚层：骨和软骨、横纹肌、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等内胚层：柱状上皮、肠管样组织等体外分化ESEB贴壁诱导约5~7天后出现自主性搏动AFP(endoderm)Troponin(mesoderm)Tubulin(ectoderm)Nestin(ectoderm)定向分化脂肪细胞神经元细胞肝细胞神经干细胞•广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内•可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。鉴定方法•形态学特征：可做悬浮培养或贴壁培养•特异性抗原表达：Nestin•分化能力：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞形态学特征悬浮培养1.“神经球”样结构2.悬浮状生长3.细胞无明显的突起贴壁培养1.需用PLL及Lamin包被生长表面2.多角形或梭形大鼠神经干细胞-悬浮培养大鼠神经干细胞-贴壁培养小鼠神经干细胞-贴壁培养小鼠神经干细胞-贴壁培养特异性抗原表达•≥75%positivefornestin(neuralstemcellmarker)；•≤10%positiveforβ3-tubulin(neuronalmarker)；≤10%positiveforGFAP(astrocytemarker)；•≤10%positiveforGalCoroligodendrocytespecificproteinOSP(oligodendrocytemarkerRatNSCnestinstainingMouseNSCnestinstaining•≥10%positiveforβ3-tubulin(neuronalmarker);•≥30%positiveforGFAP(astrocytemarker);•≥2%positiveforoligodendrocytespecificproteinOSP(oligodendrocytemarker)分化能力自然分化：加入含血清培养液，继续培养约7天，可分化为神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。三者的分化比例约为(16±7)%，(75±7)%和(5±3)%。定向分化：1.神经元方向分化：用无血清无生长因子诱导液诱导，可使分化比例升至60%以上。2.少突胶质细胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。分化方法神经细胞标志蛋白•Tubulin：即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白，神经元早期标志物。分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-tubulin和β-tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种tubulin。β-Tubulin表达和分布随着神经元发育成熟而