1/6微滴式数字PCR操作程序操作方法1.先打开电脑,再打开QX200DropletReader电源,在使用前需预热至少30分钟;2.配制探针法定量反应体系,振荡混匀,离心除气泡,注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝较完整基因组DNA),如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul,可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度;3.将一个新的DG8cartridge放入holder中,注意缺口方向;4.将20ul样品反应体系加入到DG8cartridge中间一排的8个孔内,不足8个样品时用20ul12/6×buffercontrol补足,建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头(不能用200ul枪头),加样时枪头接近孔一侧底部,与侧壁呈大约15°角,缓慢打出液体,打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体,不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡;5.在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DGOil),同样不能有空着的孔;6.盖上胶垫(gasket),注意两边的小孔都要钩牢;3/67.将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中,开始生成微滴,注意仪器上指示灯状态,一般2分钟之内完成;8.微滴生成于cartridge最上面一排孔内,建议使用Rainin的8通道P‐50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取,调整吸取体积为40ul,将holder放平,枪头以与孔壁呈30~45°角放入,轻触孔底,约5秒吸取40ul,再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒),枪头贴近孔壁接近孔底,注意封上盖以防油挥发,每次弃去已使用过的cartridge和胶垫;4/69.转移油滴进入96孔板内完成后,用预热好的PX1热封仪对其进行封膜(膜亮面朝上,暗面向下),推荐的运行程序为:180℃,10s,无需颠倒方向二次封膜;10.封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应,或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR,可在任意一台96孔PCR仪上完成,注意升降温速度≤2.5℃/s。推荐反应条件:1.95℃,10min;2.94℃,30s40循环Tm(退火温度按优化摸索得来的条件设置),60s;3.98℃,10min;11.查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(不同说明书上稍有不同);5/612.将之前完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好,注意板斜角方位,如下图所示:6/613.组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中,如图:14.打开QuantaSoft软件,建议每次实验之前做一次FlushSystem,若一周以上未使用建议先做一次Prime再做FlushSystem。之后对96孔板中样品信息进行Setup,主要是提供实验名称、实验类型(ABS、CNV、RED)、assay以及探针信息等,完成后即可进行Run,结束后结果会被自动Analyze,人工核实后保存结果,即完成了一次QX100实验。