核酸分离纯化-经典版剖析

核酸的分离纯化技术核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。概述一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性1.意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2.实验过程中，应注意以下条件及要求：1）减少化学因素对核酸的降解:pH4-102）减少物理因素对核酸的机械剪切力：0-4C强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。（一）保持核酸分子一级结构的完整性3）抑制DNase或RNase的活性：所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。4）简化步骤，缩短时间，减少破坏。（一）保持核酸分子一级结构的完整性3.DNA酶抑制剂(1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+等离子。(2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。（一）保持核酸分子一级结构的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。(1)皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。（一）保持核酸分子一级结构的完整性(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：①DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。②容易降解，保存在4℃或液氮中；③提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。④剧毒。（一）保持核酸分子一级结构的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制剂（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)4.RNA酶（RNAase)抑制剂（一）保持核酸分子一级结构的完整性一、核酸分离、纯化原则(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。破碎组织细胞提取纯化I.材料与方法的选择II.破碎细胞或包膜－核酸的释放III.核酸分离、纯化IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质V.核酸的鉴定与保存二、分离提取核酸的主要步骤临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。（一）材料与方法的选择临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济；应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。（一）材料与方法的选择DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。（二）细胞的破碎——核酸的释放破碎细胞的方法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞，SDS可溶解细胞膜、核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与DNA分离；③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸分离。（二）细胞的破碎——核酸的释放注意：1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的提取；2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。（二）细胞的破碎——核酸的释放细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。（三）核酸的分离纯化应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质2.非目的的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质3.加入的有机溶剂和某些金属离子（三）核酸的分离纯化1.加入浓盐溶液（如NaCl）RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别。DNA核蛋白在0.14mol/L氯化钠中溶解度低，但在1–2mol/L氯化钠中溶解度高；RNA核蛋白在0.14mol/L氯化钠中溶解度仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取开来。核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；核酸分离纯化的基本方法2.加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；核酸分离纯化的基本方法3.酚/氯仿抽提细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。核酸分离纯化的基本方法酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。核酸分离纯化的基本方法(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意核酸分离纯化的基本方法沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度，提高样品浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀的方法：常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁。常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇洗涤：核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与一价或二价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA。核酸沉淀的温度和时间一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤1.核酸的鉴定①浓度鉴定②纯度鉴定③完整性鉴定（五）核酸的鉴定与保存紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。①浓度鉴定（五）核酸的鉴定与保存荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。荧光强度的强度与溶液中核酸的含量呈正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。（五）核酸的鉴定与保存EB与DNA的结合①浓度鉴定紫外分光光度法：主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。②纯度鉴定（五）核酸的鉴定与保存②纯度鉴定（五）核酸的鉴定与保存判断核酸样品的纯度：DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270）比值升高：DNA变性、RNA污染混合污染：比值正常荧光光度法：EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。（五）核酸的鉴定与保存②纯度鉴定琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性；根据电泳条带的数目、位置和形状判定，RNA分子可以通过荧光强度强弱来判定有无降解。基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状。③完整性鉴定（五）核酸的鉴定与保存DNA的降解（五）核酸的鉴定与保存完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，原核生物5S、16S、23S三条带；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三条带；而且三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低（五）核酸的鉴定与保存③完整性鉴定28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解；若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染。（五）核酸的鉴定与保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃样品经常使用-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存,避免反复冻融保存介质：灭菌水TE缓冲溶液(最常用)：10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0（五）核酸的鉴定与保存2.核酸的保存——DNA的保存DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存，-70℃冰箱可保存数年。TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时DNA易变性长期保存样品中可加入1滴氯仿。（五）核酸的鉴定与保存2.核酸的保存——DNA的保存RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。（五）核酸的鉴定与保存2.核酸的保存——RNA的保存A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。测定结果分析B：测RNA纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。